植物分子育种技巧

国内外植物育种的历史已经证实，新的育种方法的采用和新的育种途径的探索成功将会提高植物育种的效果，给植物育种带来一场深刻的革命。植物分子育种技术为物种间和属间甚至科间远缘遗传物质的导人和交换，进而为快速培育高产、多抗和优质的新品种提供有效的育种途径。可望产生出巨大的社会效益和经济效益。

1植物分子育种的概念

植物分子育种是指不经过有性过程，将外源DNA导入植物，诱发可遗传的变异，以选育带目的性状的优良品种的育种技术。分子育种广义地讲包括两个层次的生物工程技术：①外源DNA导入植物的技术：即将带有目的性状的基因的供体总DNA片段导人植物，筛选获得目的性状表达的后代，培育新品种；②植物基因工程技术：即将目的基因分离出来，在体外构建重组分子再导人植物细胞，然后通过离体培养并筛选获得目的基因表达的植株，培育新品种。狭义的分子育种指的是第一个层次的分子育种即外源DNA导入植物的技术。

2植物分子育种的特点

我国育种学家对水稻、小麦、大麦、棉花、高梁、大豆、马铃薯、蚕豆等作物长达20年的探索后掌握了植物分子育种如下一些特点：

(1)操作简单。基因工程技术自50年代初使用以来，在作物育种中的应用进展缓慢，主要原因是难以找到理想的目的基因，因为作物的主要经济性状一般是数量性状，这些性状受微效多基因控制，难于识别和分离。此外，在通过基因工程改造作物的过程中很难找到合适的基因载体。我国的植物分子育种以异源DNA片段有可能在受体植物细胞内形成部分杂交片段的假说为基础，通过适当的导人方法很容易将供体的总DNA导人受体细胞内，由此引起受体发生遗传性变异，为育种家提供丰富的遗传变异资源，因而是简单易行的育种新途径。

(2)变异范围广。周光宇、陈启锋和黄骏麒等认为，异源DNA导人受体细胞后，由于供体与受体的异源遗传物质的相互作用，其中包括DNA片段的插人、整合、调控和启动等，会引起受体产生多种多样的遗传性变异。受体所产生的遗传性变异涉及到作物的各类质量性状和数量性状，其中包括植株的形态变异、生长发育速度、生理生化特性、抗病虫能力、产量构成潜力和品质改良以及抗逆性等等。从受体的变异性状来看，一般在Dl代出现变异性状，少数在D2代和D3代才出现变异性状。变异性状包括供体所特有的性状和双亲均没有的新性状。这些新性状在后代中能稳定遗传或继续发生性状分离。所以，通过

DNA直接导人法能获得广泛的变异后代，为新品种的选育提供了丰富的物质基础。

(3)后代稳定快。通过远缘杂交所获得的杂种后代群体会发生“疯狂分离”，随后还需要经过8～10个世代的严格筛选才有可能培育出稳定的新品系。通过异源DNA直接导人法所获得的转基因植株后代群体一般只经过4～5个世代就能选育出带有远缘优良性状的新品系，由此可以缩短育种时间，提高育种效果。

3植物分子育种技术

(1)供体DNA的提取：大多数的供体DNA的提取是根据Marmur的方法进行改进的，主要用酶法或离子交换柱法除去RNA及蛋白质获得较纯的DNA分子。农业分子育种的目的是获得带有目的性状的新品系，为此作为供体DNA必须含有表达目的性状的基因(DNA片段)。用于提取DNA的植物材料，一般选用细胞分裂旺盛、DNA含量高的幼嫩器官或组织。

(2)外源DNA分子导人植物的途径和方法：外源

DNA导入技术可分为两类，一类是以分离培养的细胞为受体，导人DNA后再生植株，另一类是从整体植株体内的细胞为受体、直接得到DNA转化的种子。后者比前者简单、直接，可直接以作物的植株在田间进行导人和选育新品种。以整体植物的细胞为受体的导人技术又可分为两种，一种是以种胚细胞为受体，另一种是以生长点细胞为受体。前者包括授粉前、后的卵细胞及不同发时期的种胚细胞为受体的技术，以生长点细胞为受体的技术是用

DNA溶液浸泡成熟种子或幼苗。具体方法如下：1花粉管通道技术：植物受粉后，花粉在柱头上萌发形成花粉管，穿过花柱进入子房，沿子房的内壁或胎座生长直达胚珠，通常经过珠孔进入胚襄。花粉管通道技术是以整体植株的种胚细胞为受体，通过花粉管这条通道将外源DNA导人胚襄中，转化受精卵或其前后的种胚细胞，使其自然发育成种子，再观察后代的变异。这项技术可应用于所有的开花植物。又分为：花柱切口滴人法和子房微注射法。2

DNA溶液浸泡细胞分裂旺盛的组织以外源DNA溶液浸种、催芽、浸苗、浸穗等。目前正发展一种减压渗透法，即将脱壳的受体种子经蒸馏水浸泡一段时间后，在负压下将种子浸入供体DNA溶液中由渗透导人适当时间。3离体培养法：在花粉、种胚等的诱导分化培养基上加入外源DNA。4射击穿人法：利用基因枪、电击法等把外源

DNA直接导入受体。

(3)外源DNA导人技术的分子验证：中国科学院。上海生化所与江苏省农科院经作所，应用缺口翻译法3H标记棉花DNA分子(50kb)，于棉花自花授粉后24小时从子房顶部注入。经过30分钟到8小时之间分别取样，冷冻切片，放射自显影，可以观察到30分钟后胚襄内已有3H-DNAa除从珠孔到胚襄间的花粉管通道外，珠心的任何其它部位均无自显影斑点，进入胚襄的花粉管内亦无同位素。实验证明花粉管珠心通道是外源DNA从珠孔到达胚襄内的唯一途径。翁坚等用MP，质粒与受体重复顺序重组导入棉花，取成熟种子DNA经Sau3A确切，以

MP：为探针，用Southern

blot分子杂交证明MPG整合进入了棉花基因组中：中科院上海生化所用带有卡那霉素抗性基因的质粒与受体的共同顺序重组后导入棉花与水稻，在子代中均筛选出具卡那霉素抗性的植株，这些实验进一步从分子水平上验证了外源DNA导入技术的可行性。上述工作是用已知基因重组分子导人植物后的分子验证，其结果只能说明外源DNA(基因)导入技术的可行性。至于应用供体总DNA进行的分子育种，只能根据子代的性状或基因产物的差异予以判断。DNA结构很复杂，除结构基因外，还有调控基因、重复序列DNA，这些

DNA进入受体都会产生一定的影响。只有少数片段被整合，整合的DNA还必须和受体DNA在结构、功能上有一定的亲和性。当用总DNA导入后，受体的性状得到改变，并能遗传，就可以说明外源DNA进去了。

(4)外源DNA导人所引起的性状变异及其假说：外源DNA导人受体后所引起的后代变异极为广泛和复杂，后代的分离多数不符合孟德尔遗传理论，其分离无一定规律。对此乃文举(1992)提出“生物诱变”假说，认为外源

DNA具有双重作用：一是基因转移作用，二是诱变作用。外源DNA导人后产生的“广幅分离”是生物诱变的结果。生物诱变具有引发或再启动系统发育中曾经潜伏下来的性状的作用，使其重新表达。

4植物分子育种的应用

分子育种最初被认为是“异端邪学”，80年代后由于它的诸多成果而逐渐被学术界承认和接受。据不完全统计，到目前为止，全国有21个省市40多个实验室开展了分子育种研究，美洲、欧洲、亚洲少数实验室也开始应用这一技术于稻、麦、棉、豌豆、牧草等基因重组分子和供体总DNA导入研究。我国自开展分子育种以来，在许多作物，尤其是水稻、大麦、小麦、棉花、高梁、大豆，马铃薯、蚕豆的育种方面，取得突破性的进展。

(1)水稻育种方面：广西农科院李道远等将药用野生稻DNA导入栽培稻，选育出耐旱、耐瘩、高产的糯稻桂

D1号，已大面积推广．吉林通化市农科所朴享茂等将抗属的基因导入水稻，选育出多抗、高产、优质的一批新品种．湖南农院乃文举等用浸胚法将玉米的DNA导入水稻，选育出高产，优质的GEK-1，目前正在湖南的长江中下游水稻高产区大面积推广。

(2)麦类育种方面：河南农科院等4家实验室成功地转移了白粉病抗性基因。如河南省农科院小麦所阎新甫等将抗白粉病的二棱大麦DNA，通过花粉管通道技术导入小麦感病品种，后代中出现了高抗的变异株。

(3)棉花育种方面：江苏省农科院经作所黄骏麒等用耐黄萎病的海岛棉DNA导人抗枯萎病陆地棉，选育出耐黄抗枯新品种3118棉，已在长江中下游累计种植8万余亩，大田增产达15％。他们还将茵麻DNA导入海岛棉，得到高产长绒棉。湘棉12号是湖南农学院吴小月等用中棉

DNA导入陆地棉培育的新品种，已通过鉴定，在省内外试种6万余田。

(4)大豆育种方面：已有6家实验室获得一些有益基因转移的变异植株。5植物分子育种的展望

植物分子育种研究经历了30多个春秋，取得了很大的进展，技术日臻完善，今后的主要目标有三点：

(1)与常规育种相结合将技术广泛的应用于多种作物，培育新品种，创造新资源。目前，我们已将该项技术应用于蔬菜、高粱、玉米、水稻、小麦、大麦、亚麻及马铃薯等作物，有些作物已获得了变异材料和品系。

(2)与基因工程结合将目的基因导人农作物，筛选获得目的基因表达的后代，培育新品种。

(3)利用分子生物和基因工程的理论与技术，探索总DNA导人后代的基因识别与分离。

植物分子育种正以其独特的魅力逐渐脱颖而出。有人预言，21世纪将是生物技术大发展的世纪，它将为我国解决人口多，人均资源少的农业面貌改观开辟广阔的前景。

《农业网络信息》2007.10.221,235～236

王烨1，王辉1，蔡震2，刘英2

(1.河北农业大学现代教育技术中心，河北保定071001；

2.华北电力大学保定校区，河北保定071000)