荷花(Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ)为睡莲科莲属的宿根水生花卉,是中国的传统名花和重要的经济植物。我国荷花品种资源十分丰富,由于花莲多为自然杂交或人工杂交品种,播种繁殖难以保持原品种性状,再者花莲中的许多品种常因雌雄蕊瓣化而不易结实,因此,资源圃荷花品种传统的繁殖及保存方法主要采用分藕和大面积缸栽或池植。但是,荷花的分藕繁殖系数较低,这个问题现已成为限制荷花种植业发展的主要障碍。此外,有些品种因生长势弱,品种保存十分困难。为了能充分利用品种资源,及时为商业化生产提供大量优良种苗,同时又能为珍贵品种的保存开辟新途径,我们对一些珍贵荷花品种进行了组织培养试验,筛选出较为合适的培养基,并获得了大量荷花组培苗,现将试验结果报道如下。
1 材料与方法
11 供试材料
试材取自杭州市园文局灵隐管理处曲院风荷水生植物资源圃,包括厦门碗莲、白玉、佛手观音、佛座和贵妃等5个珍贵品种。
12 外植体处理
选取以上品种的冬眠种藕,用水冲去污泥,然后将茎尖连叶鞘一起切下,用2%洗衣粉溶液轻轻刷净,自来水冲洗30ｍｉｎ后用纱布吸干,剥去外层叶鞘,置于超净工作台上。在75%酒精溶液中浸泡1ｍｉｎ,然后用01%升汞消毒10～12ｍｉｎ,消毒后无菌水冲4～5遍,再剥去内层叶鞘,接入培养基。
13 培养基
试验中ＭＳ培养基为基本培养基,含琼脂5ｇＬ,ｐＨ值58。在ＭＳ培养基中分别加入赤霉素ＧＡ02ｍｇＬ和不同浓度的细胞分裂素ＢＡ(02～08ｍｇＬ),培养一段时间后,观察不同激素水平对诱芽的影响。待幼叶长出后转入增殖培养基,在ＭＳ培养基中添加不同浓度的ＢＡ(02～10ｍｇＬ)、ＧＡ(0～05ｍｇＬ)和生长素ＩＢＡ(0～05ｍｇＬ),观察不同激素水平对增殖的影响。在相同激素水平的情况下,用固体(加琼脂5ｇＬ)和液体2种培养基进行增殖培养。若干天后,观察两者的增殖结果。将经增殖培养后带有茎段的小苗转入添加ＩＢＡ(0～18ｍｇＬ)或生长素ＮＡＡ(0～14ｍｇＬ)的生根培养基中,观察不同激素对生根的影响。培养室恒温为25℃,光照强度为2000ｌｘ,每天光照14ｈ。
14 移栽炼苗]
将试管苗分别栽入营养液(Ｋ∶Ｎ∶Ｐ∶Ｍｇ∶Ｃａ=22∶13∶1∶1∶3)、黄沙、西湖淤泥(西湖淤泥∶泥炭∶基肥=8∶2∶2)等基质中,黄沙和西湖淤泥经高温灭菌,使用时加营养液呈稀糊状,调查试管苗的成活率。
2 结果与分析
21 不同激素水平对诱芽率的影响
经20ｄ培养后结果(表1)可见,各参试荷花品种芽的诱导率均以采用ＭＳ+ＢＡ04(ＢＡ04表示加入ＢＡ04ｍｇＬ,下同)+ＧＡ02诱导培养基时最高。5个品种中,贵妃诱导率较低,仅10%～55%。而另4个品种,采用ＭＳ+ＢＡ04+ＧＡ02诱导培养基时,诱导率均在80%～90%。ＭＳ+ＢＡ02+ＧＡ02处理的诱导率虽然也比较高,但芽细小,叶柄细长,生长势弱。ＭＳ+ＢＡ08+ＧＡ02诱导培养基发出的芽比较粗壮,叶柄短,叶片卷曲、较厚,但诱导率较低,大约14ｄ以后有幼叶长出。试验结果可见,ＢＡ浓度高于04ｍｇＬ,达到08ｍｇＬ时,荷花的芽诱导受到了抑制,故诱导培养基以ＭＳ+ＢＡ04+ＧＡ02为好。
22 不同激素水平对增殖的影响
将已发芽并带幼叶的小苗转入不同激素、不同浓度的培养基中培养25ｄ后,发现厦门碗莲、白玉、佛手观音和佛座等4个品种的大多数小苗能发出1～3个新芽,部分小苗还能长出茎段,贵妃芽的增殖频率、芽的平均增殖系数和发出茎段的频率明显低于其它4个品种。
当在添加了ＢＡ08ｍｇＬ的ＭＳ培养基中再添加ＧＡ05ｍｇＬ或ＩＢＡ05ｍｇＬ时,除贵妃外,其它4个品种的芽增殖频率均在70%～90%。但该2组处理的茎段增殖频率相差很大,添加ＧＡ05ｍｇＬ的处理除贵妃外,均在55%以上;而添加ＩＢＡ05ｍｇＬ的处理则都在0～10%。由此可见,ＢＡ无论和ＧＡ合用,还是和ＩＢＡ合用,芽的增殖频率相差不多,但ＧＡ可明显促进茎段的发生。试验结果还可以看出,随着ＢＡ浓度由低到高,芽的增殖频率也呈现由低到高的趋势。至ＢＡ08ｍｇＬ时增殖率最高,而当ＢＡ浓度达到10ｍｇＬ时,荷花茎段的发生则受到了抑制。从以上结果可见,荷花的增殖培养基以ＭＳ+ＢＡ08+ＧＡ05较合适。
23 固体和液体培养基对增殖的影响
用ＭＳ+ＢＡ08+ＧＡ05固体和液体2种培养基同时继代10ｄ,都能发出新芽。继代25ｄ后,两者的增殖频率差别不大(表5),液体培养基的平均增殖系数略低,但植株健壮,且不干枯;而固体培养基内会出现叶片及叶柄干枯的情况,且植株细弱。在实际操作中,两者交替使用,可达到好的效果。
24 不同激素水平对生根的影响
增殖培养25～30ｄ,将带有茎段的小苗转入生根培养基培养20ｄ后可见,不同激素水平的对荷花根的促生作用有很大区别(表6),个别小苗在第7ｄ有根长出,多数在20ｄ后长根。当ＩＢＡ浓度分别为06ｍｇＬ、10ｍｇＬ和14ｍｇＬ时,生根率呈现从低到高的趋势;当ＩＢＡ浓度达到18ｍｇＬ时,生根率下降。试验结果可见,添加ＮＡＡ各处理的生根率都很小。ＬＳＤ法测定结果显示,试验处理中,以ＭＳ+ＩＢＡ14的生根率最高,均在55%以上,最高可达833%。
25 试管苗的移栽
在移栽试验中我们发现,将已长根的小苗从瓶中轻轻移出后,须在自来水中放置2～3ｄ(每天换水),再植入备好的基质中,小苗栽植深度以2ｃｍ为宜,移栽14ｄ以后长出新根,30ｄ后发出新芽,此时,可逐渐提高水位。在营养液、黄沙及西湖淤泥等3种移栽基质中,黄沙和营养液荷花试管苗成活率分别为556%和455%,以西湖淤泥的成活率最高,达到727%。
3 小结与讨论
诱芽培养基以选用ＭＳ+ＢＡ04ｍｇＬ+ＧＡ02ｍｇＬ最为理想,既能获得较高的诱导率,又能保证荷花生长健壮。增殖培养时,在ＭＳ培养基中添加ＢＡ08ｍｇＬ或ＢＡ10ｍｇＬ与ＧＡ配合使用,能获得较高的增殖率,但连续继代2次以上,会出现畸型苗,如果和ＢＡ04ｍｇＬ+ＧＡ02ｍｇＬ交替使用,能最大程度地避免这种情况发生。与此同时,还应将固体培养基和液体培养基交替使用,这样才能得到多而健壮的小苗。在生根培养中,ＩＢＡ的促生根作用明显优于ＮＡＡ。当2种激素的浓度同为14ｍｇＬ时,ＩＢＡ最高生根率能达到833%,而ＮＡＡ只有133%,所以,荷花生根培养用ＩＢＡ效果较好。厦门碗莲、白玉、佛手观音和佛座等4个品种,在整个离体培养过程中生长情况区别不大,只有贵妃的诱芽率、增殖率和生根率都较低,这说明不同品种材料的异质性,应考虑调整培养基的激素水平[5]。试管苗出瓶后,先要在自来水中放置2～3ｄ洗净培养基质,再移入经消毒过的西湖淤泥,成活率可达727%。
