摘要：营养液培养试验，设缺硼、钼和加硼、钼处理，培养后的草坪草海滨雀稗进行2周适温和零上低温处理，研究低温下其活性氧代谢及硼、钼对活性氧代谢的影响。结果表明，与缺硼、钼相比，加硼、钼处理极显着提高低温下草坪草超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，极显着降低过氧化物酶(POD)活性，极显着降低超氧阴离子( )产生速率，显着降低 质膜电解质相对渗透率，有降低丙二醛(MDA)含量的趋势。而在常温下施硼、铝作用不如低温下明显。在低温下，草坪草超氧阴离子水平极显着升高，MDA含量升高，组织电解质相对外渗率增大，SOD、CAT、POD显着下降表明草坪草已遭受低温寒害，而施硼、钼改善了上述生理生化状况，提高了草坪草抗寒力。
关键词：海滨雀稗；抗寒力；活性氧；硼；钼
珠江三角洲地区地处水热条件十分优越的南亚热带，具有发展常绿型草坪的良好条件，目前正在应用的草坪草种主体是暖季型草种，如狗牙根、雀稗、结缕草、地毯草等，这些草种夏秋季生产良好，但冬季气温低于10~C时，很快叶色发黄休眠。广州有80％以上暖季型草坪在冬季枯黄，景观价值及实用价值大大降低。同时寒冷常引起大面积病害，寒害和病害并发，造成草坪大面积死亡。因此如何提高草坪草抗寒力是目前南方草坪业及高尔夫事业发展面临的一大难题。
低温下植物抗寒力的高低是内部遗传特性的表现，同时也受环境因素的影响。如施肥不当，造成草坪植物营养失调，即不利于抵御冬春季低温寒潮。近年来的研究表明，钼和硼都能提高植物包括抗寒力在内的各种抗逆性，通过维持细胞膜及细胞壁结构稳定性，提高CAT、POD、SOD等酶的活性，减轻氧自由基伤害，提高植物抗寒力。然而关于硼钼配施在草坪作物上的应用及报道少。本文通过研究硼钼对海滨雀稗低温逆境下活性氧代谢的影响，旨在揭示硼钼在草坪植物抗性生理中的作用，探索提高草坪草抗寒力的措施。
1 材料与方法
1．1 培养方法
海滨雀稗Seashore paspalum(Paspalum vaginatumSwartz．)，来自广东国安草场，种植于佛山科学技术学院草坪基地。取草之茎节，在铺有单层海绵的瓷盘中，以水培及压条法进行无性繁殖。采用改良Hoagland营养液，每盘400 mL，设不加硼钼(一BMo)和加硼钼(+ BMo，H3 BO3，25 tLmol／L；Na2M0o4·2H，O，1 tLmol／L)2处理，重复8次。所用海绵和瓷盘等用具，先用1 mol／L HC1浸泡48 h后，用去离子水冲洗干净。营养液用去离子水配制，试剂均为分析纯。先用1／4营养液培养1周后，再用1／2营养液培养1周，然后采用完全营养液培养。每天更换营养液，培养16 d后一半草作适温对照(30℃／25℃)，一半草进行低温处理，根据广东省冬季气候特点，每天(15±1)oC照光8 h，光强600 gmol·m～·s～，(5±1)oC黑暗16 h。处理2周后取第1、2片完全展开叶，进行各项生理生化指标的测定。
1．2 测定方法
1．2．1 O 产生速率测定 按王爱国和罗广华的方法，单位为nmol·g ·min～。1．2．2 SOD活性测定 按Beyer和Fridovich 的方法，以单位时间内抑制光化还原50％的氮蓝四唑 (NBT)为一个酶活性单位(u)，以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g )计。
1．2．3 MDA含量测定 按Heath和Packer 的方法。
1．2．4 CAT活性提取测定 按文献[8]方法。酶活性单位u为25℃每分钟催化1 mol H：O 分解的酶量。以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g FW)计。
1．2．5 POD活性测定 按文献[8]方法。POD活性单位u为25℃每分钟氧化1 gmol愈创木酚的酶量。以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g )计。
1．2．6 组织电解质相对外渗率 参照张宪政的方法测定。
1．3 数据分析和统计
采用SAS 6．12进行数据分析和统计。
2 结果
2．1 超氧阴离子
研究表明：硼、钼的施用在常温下和低温下均极显着降低超氧阴离子产生速率(P<0．01)，由于低温逆境下超氧阴离子产生速率极显着升高，为常温下的2倍左右，特别是不施硼、钼时其含量近8 000 nmol·g ·min～，对生物膜造成极大的威胁。
2．2 膜脂质过氧化
研究表明：不施硼、钼时，伴随超氧阴离子产生速率的增加，生物膜脂质过氧化加剧，膜脂质过氧化产物丙二醛含量有增加的趋势。同样，低温下丙二醛含量也有增加的趋势。
2．3 质膜相对透性
研究表明，由于膜脂的过氧化作用造成生物膜损伤，膜渗透性增加，电解质相对外渗率增加。硼、钼的施用可降低质膜电解质相对外渗率，在低温下不施硼、钼和施硼、钼电解质相对外渗率差异达显着水平(P<0．05)。
2．4 SOD活性
研究表明，施硼、钼可提高SOD活性，低温下施硼、钼与不施硼、钼差异显着(P<0．05)。低温逆境使SOD活性下降的情况下，施硼、钼能维持植株较高的SOD活性，对于减轻体内活性氧伤害至关重要。
2．5 CAT活性
研究表明，常温下施用硼、钼对CAT活性的促进作用未达差异显着水平。低温处理后植物体CAT活性极显着下降(P<0．01)，但硼、钼的施用具有维持较高CAT活性的作用，其值极显着高于对照 (P<0．01)。
2．6 POD活性
研究表明，在常温和低温下，硼、钼的施用均极显着降低POD活性(P<0．01)。但与常温相比，低温逆境下POD活性不施硼、钼极显着下降，而施硼、钼处理间无差异。
3 讨论
3．1 低温下海滨雀稗受到活性氧伤害超氧阴离子(O )在植物体内是其他活性氧如羟自由基(·OH)，过氧化物(H O )及单线态氧( O )等的来源 ，可代表植物体内活性氧水平。在对草坪草海滨雀稗的研究中，常温下及营养平衡状态下，超氧阴离子产生速率较低，仅为低温及缺硼、钼三重胁迫下的1／5(图1)。而在低温下活性氧水平极显着升高，因而可能增强对植物细胞的毒害，加剧生物膜的脂质过氧化，改变生物膜的选择透性及稳定性。作为脂质过氧化标志性产物的丙二醛在低温及缺硼、钼时含量最高，表明草坪草生物膜受到的活性氧毒害及脂质过氧化加剧，膜的结构及功能完整性遭到破坏；组织电解质相对渗透率升高，表明细胞内容物渗漏增加，低温下活性氧对细胞的伤害已显而易见。在红松幼苗、番茄幼苗 、藤黄和团花幼苗 经低温处理后，也观察到H O 、O 和MDA含量升高及活性氧伤害加重的现象，表明低温下活性氧的增加及其引起的膜脂质过氧化和细胞渗漏是草坪草寒害的重要表现。
3．2 硼、钼通过维持低温下较高保护酶活性和降低活性氧水平而提高草坪草抗寒力包括海滨雀稗、狗牙根等暖季型草坪草在内的很多热带植物易受冷害袭击的一个关键原因是冷胁迫下活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生及其对植物细胞的直接伤害 。对于避免细胞膜及细胞器的活性氧损伤，植物的抗氧化系统是很重要的。但是低温下草坪草SOD、CAT和POD却一致下降，极不利于对活性氧的清除。如何减少活性氧的产生，增加对活性氧的清除是当前抗寒研究的重点。在冷害胁迫下植株生命活动减弱，酶的活性通常会降低。采取正确的施肥管理措施减少酶活性的降低及维持酶的较强活性非常必要。硼、钼的施用维持了相对较高的酶活性，有利于清除体内活性氧，降低了氧自由基水平、膜脂质过氧化及组织渗漏，提高了草坪抗寒力。
由于低温下活性氧水平上升，对活性氧的有效清除更为重要。SOD是生物体内防御氧自由基伤害的主要酶类。对草坪草的研究表明，常温下培养液中硼、钼的丰缺对SOD的影响不明显，而在低温时酶活性普遍降低的情况下，施硼、钼较不施硼、钼显着提高植株SOD活性，增强对活性氧的清除能力，提高草坪草抗低温冷害的能力。对青花菜¨酬和烟草等作物硼、钼的合理配施也都有提高SOD活性减轻氧自由基伤害的作用。研究表明，过氧化氢酶(CAT)是C 植物中H O，清除的关键酶，而且是C 植物耐受胁迫所必需的 。然而CAT米氏常数(K )高，所以CAT清除细胞内产生的低浓度H O 的作用是有限的，而对减轻高水平H O 起重要作用 。由于低温使植物体活性氧产生和清除的平衡遭到破坏，造成活性氧水平激增，CAT的作用就显得较重要。低温下缺硼、钼植株CAT活性极低，而在同样低温下施用硼、钼后CAT活性极显着提高，对于减轻低温逆境下活性氧伤害至关重要。POD属非特异性过氧化物酶，根据其位置和反应条件分为细胞壁过氧化物酶和质膜过氧化物酶，除清除活性氧功能外，前者在碱性介质中还参与植物体活性氧进发，后者在各类酚类化合物存在、NADH参与的条件下也可导致活性氧的产生。推测正是由于POD的双面性，在施用硼、钼后，PoD活性显着降低。同样在缺锌菜豆。加 、缺镁菜豆 、缺硼甘蓝型油菜 中也发现CAT活性下降、而POD升高。这些都与POD具O 和H O 的产生和H O清除双重作用分不开。硼是高等植物必需元素，但其营养机理还不太清楚，近期研究表明硼主要作用于高等植物细胞壁，通过与果胶RG．11交叉连接形成有序和稳定的细胞壁 。此外细胞骨架．细胞膜．细胞外基质连续体可能也是缺硼的主要位点。
因此硼对维持细胞壁和细胞膜结构稳定性的作用可能在低温下显得尤其重要，为其正常活性氧代谢提供较为稳定的细胞内外环境，维持较高保护酶活性，促进低温逆境下活性氧水平的降低。钼提高作物抗寒性及与光合作用有关已在冬小麦等作物得到证实，其机理正在
进一步研究中，缺钼使冬小麦谷氨酸大量累积，可达施钼时的1O倍，表明施钼可促进正常碳氮代谢 ，提高植物抗寒性。低温逆境下，草坪草活性氧显着增加，膜脂质过氧化及质膜透性加大，而SOD、CAT、POD活性显着下降，表明暖季型草坪草海滨雀稗已受到低温寒害的袭击，而施用硼、钼显着提高了草坪草SOD、CAT、POD活性，有效清除了体内的活性氧，降低了膜脂质过氧化及质膜渗漏，提高了草坪草的抗寒力。通常草坪养护中仅重视大量元素的施用，忽略微量元素，而微量元素硼、钼是中国南方铁铝土纲土壤常缺乏的元素，因此在草坪养护中，应重视微量元素硼、钼的施用，以减少氧自由基的伤害，提高暖季型草坪草的抗寒力，避免低温寒潮的不利影响。
摘要：营养液培养试验，设缺硼、钼和加硼、钼处理，培养后的草坪草海滨雀稗进行2周适温和零上低温处理，研究低温下其活性氧代谢及硼、钼对活性氧代谢的影响。结果表明，与缺硼、钼相比，加硼、钼处理极显着提高低温下草坪草超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，极显着降低过氧化物酶(POD)活性，极显着降低超氧阴离子( )产生速率，显着降低 质膜电解质相对渗透率，有降低丙二醛(MDA)含量的趋势。而在常温下施硼、铝作用不如低温下明显。在低温下，草坪草超氧阴离子水平极显着升高，MDA含量升高，组织电解质相对外渗率增大，SOD、CAT、POD显着下降表明草坪草已遭受低温寒害，而施硼、钼改善了上述生理生化状况，提高了草坪草抗寒力。
关键词：海滨雀稗；抗寒力；活性氧；硼；钼
珠江三角洲地区地处水热条件十分优越的南亚热带，具有发展常绿型草坪的良好条件，目前正在应用的草坪草种主体是暖季型草种，如狗牙根、雀稗、结缕草、地毯草等，这些草种夏秋季生产良好，但冬季气温低于10~C时，很快叶色发黄休眠。广州有80％以上暖季型草坪在冬季枯黄，景观价值及实用价值大大降低。同时寒冷常引起大面积病害，寒害和病害并发，造成草坪大面积死亡。因此如何提高草坪草抗寒力是目前南方草坪业及高尔夫事业发展面临的一大难题。
低温下植物抗寒力的高低是内部遗传特性的表现，同时也受环境因素的影响。如施肥不当，造成草坪植物营养失调，即不利于抵御冬春季低温寒潮。近年来的研究表明，钼和硼都能提高植物包括抗寒力在内的各种抗逆性，通过维持细胞膜及细胞壁结构稳定性，提高CAT、POD、SOD等酶的活性，减轻氧自由基伤害，提高植物抗寒力。然而关于硼钼配施在草坪作物上的应用及报道少。本文通过研究硼钼对海滨雀稗低温逆境下活性氧代谢的影响，旨在揭示硼钼在草坪植物抗性生理中的作用，探索提高草坪草抗寒力的措施。
1 材料与方法
1．1 培养方法
海滨雀稗Seashore paspalum(Paspalum vaginatumSwartz．)，来自广东国安草场，种植于佛山科学技术学院草坪基地。取草之茎节，在铺有单层海绵的瓷盘中，以水培及压条法进行无性繁殖。采用改良Hoagland营养液，每盘400 mL，设不加硼钼(一BMo)和加硼钼(+ BMo，H3 BO3，25 tLmol／L；Na2M0o4·2H，O，1 tLmol／L)2处理，重复8次。所用海绵和瓷盘等用具，先用1 mol／L HC1浸泡48 h后，用去离子水冲洗干净。营养液用去离子水配制，试剂均为分析纯。先用1／4营养液培养1周后，再用1／2营养液培养1周，然后采用完全营养液培养。每天更换营养液，培养16 d后一半草作适温对照(30℃／25℃)，一半草进行低温处理，根据广东省冬季气候特点，每天(15±1)oC照光8 h，光强600 gmol·m～·s～，(5±1)oC黑暗16 h。处理2周后取第1、2片完全展开叶，进行各项生理生化指标的测定。
1．2 测定方法
1．2．1 O 产生速率测定 按王爱国和罗广华的方法，单位为nmol·g ·min～。1．2．2 SOD活性测定 按Beyer和Fridovich 的方法，以单位时间内抑制光化还原50％的氮蓝四唑 (NBT)为一个酶活性单位(u)，以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g )计。
1．2．3 MDA含量测定 按Heath和Packer 的方法。
1．2．4 CAT活性提取测定 按文献[8]方法。酶活性单位u为25℃每分钟催化1 mol H：O 分解的酶量。以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g FW)计。
1．2．5 POD活性测定 按文献[8]方法。POD活性单位u为25℃每分钟氧化1 gmol愈创木酚的酶量。以每克鲜样所含的酶活性单位(U／g )计。
1．2．6 组织电解质相对外渗率 参照张宪政的方法测定。
1．3 数据分析和统计
采用SAS 6．12进行数据分析和统计。
2 结果
2．1 超氧阴离子
研究表明：硼、钼的施用在常温下和低温下均极显着降低超氧阴离子产生速率(P<0．01)，由于低温逆境下超氧阴离子产生速率极显着升高，为常温下的2倍左右，特别是不施硼、钼时其含量近8 000 nmol·g ·min～，对生物膜造成极大的威胁。
2．2 膜脂质过氧化
研究表明：不施硼、钼时，伴随超氧阴离子产生速率的增加，生物膜脂质过氧化加剧，膜脂质过氧化产物丙二醛含量有增加的趋势。同样，低温下丙二醛含量也有增加的趋势。
2．3 质膜相对透性
研究表明，由于膜脂的过氧化作用造成生物膜损伤，膜渗透性增加，电解质相对外渗率增加。硼、钼的施用可降低质膜电解质相对外渗率，在低温下不施硼、钼和施硼、钼电解质相对外渗率差异达显着水平(P<0．05)。
2．4 SOD活性
研究表明，施硼、钼可提高SOD活性，低温下施硼、钼与不施硼、钼差异显着(P<0．05)。低温逆境使SOD活性下降的情况下，施硼、钼能维持植株较高的SOD活性，对于减轻体内活性氧伤害至关重要。
2．5 CAT活性
研究表明，常温下施用硼、钼对CAT活性的促进作用未达差异显着水平。低温处理后植物体CAT活性极显着下降(P<0．01)，但硼、钼的施用具有维持较高CAT活性的作用，其值极显着高于对照 (P<0．01)。
2．6 POD活性
研究表明，在常温和低温下，硼、钼的施用均极显着降低POD活性(P<0．01)。但与常温相比，低温逆境下POD活性不施硼、钼极显着下降，而施硼、钼处理间无差异。
3 讨论
3．1 低温下海滨雀稗受到活性氧伤害超氧阴离子(O )在植物体内是其他活性氧如羟自由基(·OH)，过氧化物(H O )及单线态氧( O )等的来源 ，可代表植物体内活性氧水平。在对草坪草海滨雀稗的研究中，常温下及营养平衡状态下，超氧阴离子产生速率较低，仅为低温及缺硼、钼三重胁迫下的1／5(图1)。而在低温下活性氧水平极显着升高，因而可能增强对植物细胞的毒害，加剧生物膜的脂质过氧化，改变生物膜的选择透性及稳定性。作为脂质过氧化标志性产物的丙二醛在低温及缺硼、钼时含量最高，表明草坪草生物膜受到的活性氧毒害及脂质过氧化加剧，膜的结构及功能完整性遭到破坏；组织电解质相对渗透率升高，表明细胞内容物渗漏增加，低温下活性氧对细胞的伤害已显而易见。在红松幼苗、番茄幼苗 、藤黄和团花幼苗 经低温处理后，也观察到H O 、O 和MDA含量升高及活性氧伤害加重的现象，表明低温下活性氧的增加及其引起的膜脂质过氧化和细胞渗漏是草坪草寒害的重要表现。
3．2 硼、钼通过维持低温下较高保护酶活性和降低活性氧水平而提高草坪草抗寒力包括海滨雀稗、狗牙根等暖季型草坪草在内的很多热带植物易受冷害袭击的一个关键原因是冷胁迫下活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生及其对植物细胞的直接伤害 。对于避免细胞膜及细胞器的活性氧损伤，植物的抗氧化系统是很重要的。但是低温下草坪草SOD、CAT和POD却一致下降，极不利于对活性氧的清除。如何减少活性氧的产生，增加对活性氧的清除是当前抗寒研究的重点。在冷害胁迫下植株生命活动减弱，酶的活性通常会降低。采取正确的施肥管理措施减少酶活性的降低及维持酶的较强活性非常必要。硼、钼的施用维持了相对较高的酶活性，有利于清除体内活性氧，降低了氧自由基水平、膜脂质过氧化及组织渗漏，提高了草坪抗寒力。
由于低温下活性氧水平上升，对活性氧的有效清除更为重要。SOD是生物体内防御氧自由基伤害的主要酶类。对草坪草的研究表明，常温下培养液中硼、钼的丰缺对SOD的影响不明显，而在低温时酶活性普遍降低的情况下，施硼、钼较不施硼、钼显着提高植株SOD活性，增强对活性氧的清除能力，提高草坪草抗低温冷害的能力。对青花菜¨酬和烟草等作物硼、钼的合理配施也都有提高SOD活性减轻氧自由基伤害的作用。研究表明，过氧化氢酶(CAT)是C 植物中H O，清除的关键酶，而且是C 植物耐受胁迫所必需的 。然而CAT米氏常数(K )高，所以CAT清除细胞内产生的低浓度H O 的作用是有限的，而对减轻高水平H O 起重要作用 。由于低温使植物体活性氧产生和清除的平衡遭到破坏，造成活性氧水平激增，CAT的作用就显得较重要。低温下缺硼、钼植株CAT活性极低，而在同样低温下施用硼、钼后CAT活性极显着提高，对于减轻低温逆境下活性氧伤害至关重要。POD属非特异性过氧化物酶，根据其位置和反应条件分为细胞壁过氧化物酶和质膜过氧化物酶，除清除活性氧功能外，前者在碱性介质中还参与植物体活性氧进发，后者在各类酚类化合物存在、NADH参与的条件下也可导致活性氧的产生。推测正是由于POD的双面性，在施用硼、钼后，PoD活性显着降低。同样在缺锌菜豆。加 、缺镁菜豆 、缺硼甘蓝型油菜 中也发现CAT活性下降、而POD升高。这些都与POD具O 和H O 的产生和H O清除双重作用分不开。硼是高等植物必需元素，但其营养机理还不太清楚，近期研究表明硼主要作用于高等植物细胞壁，通过与果胶RG．11交叉连接形成有序和稳定的细胞壁 。此外细胞骨架．细胞膜．细胞外基质连续体可能也是缺硼的主要位点。
因此硼对维持细胞壁和细胞膜结构稳定性的作用可能在低温下显得尤其重要，为其正常活性氧代谢提供较为稳定的细胞内外环境，维持较高保护酶活性，促进低温逆境下活性氧水平的降低。钼提高作物抗寒性及与光合作用有关已在冬小麦等作物得到证实，其机理正在
进一步研究中，缺钼使冬小麦谷氨酸大量累积，可达施钼时的1O倍，表明施钼可促进正常碳氮代谢 ，提高植物抗寒性。低温逆境下，草坪草活性氧显着增加，膜脂质过氧化及质膜透性加大，而SOD、CAT、POD活性显着下降，表明暖季型草坪草海滨雀稗已受到低温寒害的袭击，而施用硼、钼显着提高了草坪草SOD、CAT、POD活性，有效清除了体内的活性氧，降低了膜脂质过氧化及质膜渗漏，提高了草坪草的抗寒力。通常草坪养护中仅重视大量元素的施用，忽略微量元素，而微量元素硼、钼是中国南方铁铝土纲土壤常缺乏的元素，因此在草坪养护中，应重视微量元素硼、钼的施用，以减少氧自由基的伤害，提高暖季型草坪草的抗寒力，避免低温寒潮的不利影响。 (作者：喻 敏 陈跃进 萧洪东 王惠珍 王 芳 孙秀华 山科学技术学院园艺系，广东佛山528000)
