中国兰新芽成长期正值南方高温高湿的多雨季节,杂菌繁衍猖獗,土壤、介质中带菌尤为严重。供接种取样的兰盆介质应尽少带杂菌,不施有机肥,摆放在透光避雨处,当新芽初露时即让新苗裸器上面。取6-13cm长的新芽,从植株基部切高,用刮刀除去根、赃物和外包叶2-3片,充分洗净后将材料再切取2-3cm长,在10%次氯酸的药液中消毒10分钟。如带菌严重,使用0.I1%升汞和饱和漂白粉上清波交叉消毒。灭菌后用无菌水冲洗数次,再放到灭菌滤纸上吸干水许,然后在解剖镜下无菌操作利取茎尖和腋芽。如果以去病毒为目的,所剥取的茎尖应在O.2mm以下,否则可剥取2mm以上茎类,带2个叶原基,有利于成活。
(一)、原球茎的诱导
兰花各个一些的离体组织部能诱导发生原球茎,再经分化培养发生植株。一旦发生原球茎后,就能不时支解继队培养增殖起来,也就是建立了无性繁育系。兰花的原球茎生命力强,遗传性状稳定,对迅速繁育及种质资源保存极为有利。
外植体接种后摆放在23一25度的黑暗条件下培养,1-2十月后可分比出1至数个乳白色的原球茎,在解剖镜下观察仿佛桑果形状的园球突起,早先转绿,再经培养易呈根状茎(或呈树枝状的丛生形),。影响兰花原球茎诱导成功的要素有:
1、品类的影响:差别品系由于遗传类型、内源激素和多酚类物质含量等囚素的差异,诱导启动的难度也不尽相同。
2、培养基的影响:各品系对区别培养基的适应程度区别。春兰类品系以White+BA;+NAA5+CM8.5%和B11+BA+NAA2为好。“夏蕙”、“秋素”等则以MS+BA0.5+NAA1十活性炭0.5%的培养基为好。初步观察,春兰品系适应以无机盐浓度和氨态氮含量低,而成长素含量高的培养基。“夏蕙”、“秋素”等品类则适应无机盐浓度较高、成长素含量较低的培养基。
3、新芽氏度及材料类别的影响:茎尖无论启动率和成功率均高于测芽以9-13公分的新芽诱导,成功率最高。
4、诱导启动后褐变死亡的影响:国兰品类的茎顶接种后成活并膨大呈桑果状原球茎因为启动,成功率尚好,但启动后容易褐变死亡,是国兰组培失利的起因之一。据四川农科院生物技术研究所的资料,褐变死亡数几乎占3/4。由于国兰芽端具有较多的多酚氧化酶,经茎项培养易褐化而死亡,如采用较大的外植体接种,下降培养温度、暗培养、尽量减少伤口面以及在培养基中附加褐变控制剂(常用抗氧化剂,如芸香苷,柠檬酸等),或配合利用活性炭等,有减轻褐变死亡的成效。
(二)、兰科植物多经过原球茎渠道分化产生植株。热带兰原球茎多呈园球状,国兰的原球茎则呈丛生状(根状茎)。原球茎出现阶段是兰花大量繁育的有利阶段,是迅速繁育,提升增殖率的主要环节。茎尖,侧芽接种3-6个月后,根状茎发生时即可支解继代,增殖培养基以W和B11为基本培养基,附加NAA1-2的液体培养基为宜。摆放在漫转速转床上加光培养(1-2转/分),每隔15天替换一次培养基,间断继代3-4次后,又转入相同成分,附加有活性炭(0.3%)和柠檬酸(500mg/1)的固体培养基,每月继代一次。液培、固培交替进行。增殖培养中,原球茎的支解不可太小;培养群体不宜太少;培养液则不可过量;继代培养时间不可太长,否则原球茎成长不良,甚至死亡。原球茎能够不时地再支解、增殖,这样就建立了无性系。国兰原球茎的继件次数和时间还有待探索,但从已继代3-5年的原球茎来看,仍坚持正常的增殖和分比能力。