摘要：以中国樱桃品系泰山干樱为试材，使用李属植物C2、C5保守区引物，扩增花柱，S～RNase基因，获得4个S等位基因，测序结果表明序列大小分别为：1608、950、796、504bp。按照同源比较发现大小为796 bp的等位基因与基因库中登录的SI—RNase为同一基因，另外3个S～RNase基因为首次报导，依序列大小分别命名为S2(1608 bp，登陆号EF541168)、S4(950bp，登陆号EF541173)和S6(504 bp，登陆号EF541172)。序列解析表明S2～RNase在C3区存在终止密码子，引起翻译提早终止；S4～RNase的C5区前有插入片断；S6～RNclse在高变区比另外S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较剖析表明，中国樱桃S—RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S～RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。
关键词：中国樱桃；自交亲和；S～RNase；序列；系统树
中图分类号：S662.5 文献标识码：A
文章编号：1009～9980(2008)03～332～06
蔷薇科的多数果树，如苹果、梨、甜樱桃等的绝大多数数品系均体现为典型的配子体自交不亲和性，这对于以收获果实为目的的果树来说，自花不结实或结实率低无疑是不利的，生产上常因授粉树配置不妥、人工授粉不准时或花期遭受不良气候而影响昆虫传粉酿成减产。因此阐明果树自交亲和与不亲和的分子机制、筛选和培育自交亲和品系成为国内外科学家的主要研究目标。
在蔷薇科果树中。李属植物因其S位点区域的物理距离小而成为GSI研究的模式植物，樱桃更以其天然存在自交亲和与不亲和、二倍体与多倍体的完整系统而成为研究李属植物自交亲和与不亲和性作用机制及关系演变的梦想材料。目前，世界上普遍种植的樱桃有4个种，其中欧洲甜樱桃以其味美、外形美观等特性深受消费者喜爱，是经济种植的重要对象。因其体现为自交不亲和成为自交不亲和研究的主要材料，国内外有关其基因型鉴定、花柱S～RNase基因克隆表达及遗传特征、花粉SFB(S locus F～box)基因的克隆表达等研究均有报导；而同为种植种的中国樱桃，作为我国特有的果树种质资源，与欧洲甜樱桃在自交亲和性及不亲和性上体现截然区别，为四倍体植株，体现自交亲和性，但是在国际范围内，尚未见有关其自交亲和性分子基础的研究报导。因此，我们以中国樱桃品系泰山干樱为试材，开展花柱S～RNase基因的克隆和序列剖析，研究结果对于深切了解其自交亲和遗传信息，进一步探讨自交亲和的分子机理具有主要意义，同时也将为实现甜樱桃的自交亲和性品类选育供给参考。
1、材料和办法
1．1、材料
供试中国樱桃品系泰山干樱来自山东省果树研究所，春天选取幼嫩叶子，于液氮中速冻，置20摄氏度冰箱贮藏备用。
1．2、基因组DNA提取
基因组DNA提取采用改良CTAB法。
1．3、引物设计
采用已发表的樱桃S～RNase基因的C2区和C5区设计的通用引物Pru～C2/Pru～C5。由上海博亚生物技术有限公司合成，序列分别为：Pru～C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru～C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
1．4、PCR扩增及检测
引物Pru～C2/Pru～C5 PCR反应体系为25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反应条件为：94摄氏度预变性3 min；33个循环的94摄氏度变性60 s，56摄氏度退火45 s，72摄氏度延伸1.5 min：最后72摄氏度延伸10 min。
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统观察并拍照。
1．5、S基因扩增片段的克隆、测序
将扩增产物连接到PMD～19载体中，转入感受态DH5α大肠杆菌中进行克隆。蓝白斑筛选挑取阳性克隆，对菌液进行PCR检测，用1.5％的琼脂糖电泳检测产物，肯定插入片断为目的片段，提取质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。
1．6、序列比较和系统树的构建
应用软件DNAMAN对克隆的序列进行同源性比较；并应用Mega3.1对25个蔷薇科、茄科、玄参科的S～RNase序列做多重比较，以邻位相连法(neigh～bor～joining method)构建系统进化树。
1．7 、自交亲和性的授粉试验
于开花前1d或当天采集花蕾，取出花药。待其自然开裂，花粉散出后，收集花粉备用。对当天即将开花的花蕾在散粉前去雄，同时疏去个别成长较弱的花蕾，进行授粉套袋，每组合250朵花。授粉后72 h，随机选取10朵花，从花柱基部切取花柱，用FAA固定，使用荧光显微镜观察花粉原位萌发及花粉管成长状况，措施参照Kho等，并进行显微拍摄，每个处理重复10根花柱。套袋后1周去袋，1个月后统计座果率。
2、结果与解析
2．1、泰山干樱S～RNase基因的特异PCR扩增
用Pru～C2/Pru～C5引物对泰山干樱的基因组DNA进行PCR扩增，图谱中可扩增出4条特异片断，这与中国樱桃为四倍体植株是相符合的，即存在4个S等位基因。扩增片断大小范围在1 700~600 bp，为了便于对这4个目的条带进行进一步的剖析研究，我们将其分别命名为A、B、C、D。
2．2、泰山干樱S～RNase基因的同源性比较
为进一步剖析扩增产物的序列特性，对目的片断回收、克隆并测序。测序结果表明，特异片断A、B、C、D的大小分别为：1 658、1 001、846、565 bp。将序列结果在NCBI上同源比较，发现4个基因与李属植物樱花、扁桃、甜樱桃的S～RNases同源性在77.25％-98.31％(表1)，具有较高的同源性，可肯定扩增片断均为S～RNases的等位基因。其中片断C与吴燕等在中国樱桃平都长把红中得到并登陆的S1～RNase同源性100％，2者应为同一S等位基因。在本试验中由于设计引物部位的变化，扩增片断长出117 bp，因此我们将片段C命名为S1，为了进一步加强S基因的遗传信息，该序列信息也登录在基因库，登录号为：EF541170。而A、B、D 3个扩增片断均为首次发现的S等位基因，依片断大小分别命名为S2 RNase、S4～RNase、S6～RNase(S3，S5为本实验室登陆的另外品系的S～RNase基因)，在 [2] 原版全文
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