灵芝菌种的分离有组织分离、孢子分离及基质内菌丝分离三种方法。基质内菌丝分离因易污染较少采用。孢子分离法多在研究及菌株复壮时采用。规模生产时采用的是子实体菌丝分离法，该法操作简便，且能保持原有菌株的优良品性。
（一）子实体菌丝分离法
选取形态发育正常、无病虫害、未弹射孢子的灵芝子实体，菌盖边缘尚在生长的黄白色子实体，在无菌条件下用0.1%二氯化汞水溶液（升汞水）或75%酒精进行表面擦拭灭菌。切去菌柄基部，在菌盖中部，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块置入试管斜面培养基中央。可多分离一些试管，以供选择。试管置26~28℃恒温箱内，培养2~3日即可见菌肉上有少量白色棉絮状菌丝长出，7~8日后菌丝可长满斜面，选取灵芝菌丝生长旺盛、均匀、洁白的试管作为试验和生产用的菌种，通常称此为第一代母种试管，可保存在冰箱中供转管使用。
未形成菌盖的幼嫩菌柄亦可作为分离材料。
（二）孢子分离法
取发育正常、健壮、已开始弹射孢子的灵芝子实体。切除菌柄，无菌条件下用0.1%升汞水或75%酒精进行表面消毒，用无菌水多次冲洗，再用无菌棉擦拭干净。将菌管朝下放在经灭菌的培养皿内，外罩以用75%酒精擦拭过的玻璃罩，在25~30℃条件下经过5~6小时后孢子散落在培养皿底部，用接种针挑取少量孢子放入试管斜面培养基中部，移至培养箱中进行培养。分离用的培养基可采用普通马铃薯培养基、麸皮提取液培养基等。
孢子分离法污染率较高，应及时检查挑弃被杂菌污染的试管。待孢子萌发出菌丝时，应连同少量培养基挑出及时移管。
可将子实体切成蚕豆大的种块，用无菌铁钩固定后置三角瓶中，瓶底有1cm后培养基，塞上棉塞。见孢子弹射后并萌发出菌丝时及时移管。
野外分离灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射入培养基后及时转管。
孢子萌发后先形成一级菌丝，几天后便可形成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般即可确定为得到了灵芝菌丝。
（三）基质内菌丝分离法
这是利用灵芝生长的基质作为分离材料获得灵芝菌种的一种方法。其优点是在灵芝子实体已衰老时仍可以获得灵芝纯菌丝体。但是，在子实体生长时，基质内的灵芝菌丝体不是单独存在的，往往和细菌、放射菌、霉菌及其他真菌生长在一起。为获得纯灵芝菌丝体，分离时注意分离材料的选择，选灵芝菌丝生长好，菇木尚未腐烂的作为分离材料。分离时接种块尽可能小些，所分离的菌种要经出菇试验确认是优良菌株才可在生产上使用。
