金针菇的孢子分离法分单孢分离与多孢分离两种方法，驯化育种采用的是多孢子分离法，该法又分为“种菇”孢子弹射法和菌褶贴管壁法两种。
1、孢子弹射法
取“种菇”切去菌柄，表面用70%的酒精擦洗干净或浸入0.1%的升汞水中1～2min，无菌水冲洗数遍后，用滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内按无菌操作规程将“种菇”的菌褶朝下，用铁丝支撑置于培养皿上，放在消毒擦洗过和大型钟罩下，把灭菌过的滤纸置于培养皿容器内。整个装置要让之通气，否则罩内湿度过大，孢子反而不易落下。经过12～20小时，就可以看到在培养皿内或滤纸上散落一层白色的孢子印。用无菌接种环沾取少量的孢子，置于盛有无菌生理盐水的大试管或三角烧瓶中稀释，制成孢子悬浮液，再用无菌的注射针筒或滴管，吸取孢子悬浮液，注入1～2滴孢子液于培养基表面，并用无菌接种环涂布培养，待孢子萌发后挑取孢子萌发早、长势好的菌落进行转管培养。
2、菌褶贴管壁法
钩取一块干净、发育良好的金针菇菌褶，在无菌操作条件下，贴在斜面培养基上方的试管内壁上，为了让之贴牢，可加1～2滴无菌水在试管壁上。放好菌褶后，塞入棉塞，置于适温条件下培养。待看到培养基上产生与菌褶相应大小的雾状物时，立即将附在试管壁上的菌褶片在无菌条件下取出。待长成肉眼可见的菌丝时，挑取并放入新的试管培养基中进行培养。
孢子分离污染率较高，要剔除肉眼可见的各种杂菌。之后，挑取的各菌株一定要经过出菇试验来鉴定是否是优良的驯化菌株。
