用70％～75％酒精棉球擦拭双手和母种及接种用具。先在斜面试管上贴上标签，用碳素笔或记号笔注明接种日期、菌名等，如果只接一个品种，也可接完后拿出菌种时进行标记。
点燃酒精灯，将菌种和斜面培养基两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分，斜面向上，并使它们处于水平位置。先将棉塞用右手拧转松动，以利接种时拔出。右手拿接种针（钩），拿的方法和握笔一样，在火焰上方将工具灼烧灭菌。凡在接种时可进入试管部分，也应用火烧过，以下所有操作都要使试管口靠近火焰旁，不得离开火焰。用右手小拇指、无名指、中指同时拔掉两支试管的棉塞，并用手指夹紧。以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口，用以烧死试管口可能污染的杂菌。
将烧过接种针（钩）伸入菌种管内，先接触没有长菌丝的培养基部分，使其变凉，以避免烫死菌丝。然后轻轻挑取带少许培养基的菌丝，迅速将接种针（钩）抽出试管，注意不要使接种针碰到试管壁。在火焰旁迅速将接种针（钩）伸进另1支试管，将挑取菌丝放在斜面培养基中央。注意不要把培养基划破，也不要使菌种沾在管壁上。
抽出接种针（钩），灼烧管口，并在火焰旁将棉塞塞上，塞棉塞时，不要用试管去迎接棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气，导致污染。放回接种针（钩），将针（钩）在火焰上再烧红灭菌。放下接种针（钩）后，及时将棉塞旋紧。一般1支试管种可转接扩大斜面试管30～ 40支。
