组织分离法就是指通过菇体组织分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。因此，只要切取绿豆大的一小块菇体组织，把它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。
组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖。双核菌丝中两个核并没有融合，即双亲的染色体并没有发生重组，因此组织细胞没有孢子细胞那样具有丰富的遗传性。但是也正由于组织细胞是双核细胞。所以它们都能生育结实，不像孢子细胞那样需要经过一个配对过程。此外，组织分离培养的方法较简单，取材较广泛，无论是幼菇还是成熟菇，只要是新鲜的，即使它只有菌柄，也都能分离培养成菌种。组织分离法的操作步骤如下：
1.种耳、种菇的选择
供组织分离的种耳、种菇，必须来自优良的品系，且要选取幼嫩、肥壮、无病虫害的优良子实体。
把选出来的若干种耳、种菇，再按生产要求进行系统的比较，择优去劣，把肥壮、饱满、无病的种耳、种菇留作分离材料。淋雨或吸水的种耳、种菇易污染杂菌，一般不能作为分离材料。
2.种耳、种菇的表面无菌处理
为了得到无杂菌的培养物，种菇表面要用无菌水冲洗几次，并用无菌滤纸吸干或用0.1%的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干。只要掌握分离要领，种菇不作表面灭菌处理也是完全可以的。
3.接种块的切取
把种菇撕开，在菌盖和菌柄交界处或菌褶处，切取一小块组织作为接种材料。菌褶靠近子实体的外缘，容易沾上污物或感染杂菌。所以，分离时应选择清洁的、菌盖边缘向内卷的种菇作为分离材料。为了减少带杂菌的机会，切取组织块时，应尽量取小一些，因为肉眼看到的一小块组织，其中就有许多菌丝了，切一小块不仅可以减少污染，得到纯度高的菌种，而且容易成活。但组织块越小，越容易被接种针烫死。因此，接种针在火焰上过火消毒后，应先冷却才能接种。
4.培养
组织块移植到适宜的培养基上后，应放在适合菌丝生长的温度下培养，一般温度为23～26℃。只有这样，组织块才可以迅速恢复生长，在气候寒冷的条件下进行组织分离，更应注意保持一定的温度。
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