虫草液体菌种制作及质量检验方法（上）
井大鹏 王明辉/文
摘要：液体菌种是指菌丝体的纯培养完全在液体培养基中进行培养而成的菌种。应用液体菌种进行虫草生产能显著提高产量和质量，便于工厂化和标准化生产。本文综述了虫草液体菌种的优势，制作及质量检验方法。
关键词：虫草 液体菌种 培养液 检验方法
随着国内外市场对虫草产品需求的增加，虫草生产方式由小户型、季节性生产的模式逐渐向工厂化、标准化、周年化、规模化生产发展。伴随新技术、新工艺、新设备的研发问世，采用深层培养工艺制备虫草液体菌种已应用于生产中。由于液体菌种具有成本低、生产周期短、菌龄一致、接种简便快捷、便于管理等优点，因而深受虫草栽培者的欢迎。
一、虫草液体菌种的生产方式
一般可分为电磁搅拌法、摇瓶机法、简易深层发酵（吹氧）法、发酵罐法。
1、电磁搅拌法。设备技术比较简单，投资较少，但生产量小，生产的液体菌种是菌丝团。
2、摇瓶机法。摇瓶机培养投资少，设备技术简单，管理方便，适合一般菌种厂生产使用，生产出来的液体菌种是菌球。
3、简易深层发酵（吹氧）法 。 制作工序繁琐、配套设备要求较高、各部件必须在无菌条件下进行组装，生产的液体菌种是菌球。
4、发酵罐法 。 需要一整套的发酵设备，投资大，技术要求严格，只适用于工厂化的大规模生产，生产出来的液体菌种是菌球。
二、虫草液体菌种的培养方法
通常采用摇瓶机法和简易深层发酵（吹氧）法来生产培养液体菌种。若小规模生产，一般可采用摇瓶机法培养液体菌种。本文主要介绍摇瓶机振荡培养技术。
1、 液体培养基配方
（1）土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁 0.05%、维生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（2）土豆30%（煮汁）、蚕蛹粉2%、蔗糖１%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、维生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（3）土豆20%、葡萄糖2%、玉米粉2%、黄豆粉1%、酵母膏0.2%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、水1000ml、pH值自然。
（4）葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0.l%、磷酸二氢钾 0.1%、硫酸镁 0.05%、生长素5ml、水1000ml、pH值自然。
（5）葡萄糖2%、蛋白胨0.2 %、磷酸二氢钾0.046 %、硫酸镁0.05 %、磷酸氢二钾0.1 %、水1000ml、pH值自然。
（6）葡萄糖2%、蛋白胨0.4%、牛肉膏0.4%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05 %、维生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（7）葡萄糖3%?、豆 粉2%、玉米粉1%、硫酸镁？0.05%、磷酸二氢钾0.1%、酵母粉0.5%、水1000ml、pH值自然。
（8）葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、玉米粉2%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、水1000ml、pH值自然。
（9）葡萄糖2%、黄豆粉1%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.04%、氯化钠（食盐）0.03%、味精0.01%、维生素微量、水1000ml、 pH值自然。
（10）蔗糖3%、天门冬酰胺0.1 %、磷酸二氢钾0.125 %、硫酸镁0.03 %、氯化钠（食盐）0.05 %、水1000ml、pH值自然。
2、液体培养基的制作
（1）按配比精确称取各种营养物质。
（2）配制溶液。为避免发生沉淀，可将各种营养成分单独溶解分别制成母液，加入的顺序一般是先加缓冲化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入维生素等。最好是每种成分完全溶解后，再加入第二种营养成分。若各种成分均不发生沉淀，也可以一起加入。
若用马铃薯、玉米粉、黄豆粉等原料时，应先制取这些原料煮汁，然后再把煮汁与其它成分混合。
例如：配方一液体培养基的配制。 土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁 0.05%、维生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（3）将新鲜土豆洗净去皮、挖掉芽眼的土豆切成小块放入小锅或大烧杯中，加入一定量的水，用文火煮沸30分钟左右，至土豆软而不烂时，用6～8层布过滤，取滤汁于锅中。
（4）补水。 加水至1000～1200 ml。
（5）按配方顺序加入需加的其他营养物质，文火煮5～10分钟。
（6）充分搅拌均匀，并调PH。
一般用10％HCl或10％NaOH调pH，用pH试纸（或pH检测仪）进行测试。
（7）沉淀分装。 培养液配制好后，沉淀1小时取上清液，分装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL;750mL的瓶装量为200mL;1000mL的瓶装量为300mL，在配制培养液时，可加入0.02%的植物油或0.06%的泡敌（聚环氧丙烷甘油醚）作为消泡剂消泡，防止在培养过程中培养液产生气泡。为了击碎菌丝每瓶内加入5～10粒小玻璃珠。
（8）塞棉塞 。棉塞松紧适度，不宜过紧。加棉塞后再包扎牛皮纸封口，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。
（9）用记号笔注明培养液的名称和日期。
（10）灭菌
① 首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
② 放回灭菌桶，将包扎好的三角瓶直立放入灭菌桶内，盖上牛皮纸，三角瓶不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
③加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。
④ 通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，在1.0～1.1kg/cm2压力下，灭菌30分钟。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
⑤ 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，缓慢打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养液由于内外压力不平衡而冲出三角瓶，造成棉塞沾染培养液而发生污染。
三、摇瓶机振荡培养技术
灭菌结束后，取出培养液冷却到30℃以下时，在无菌条件下接入一块约2厘米的斜面菌种，菌丝面向上悬浮于培养液液面。在20℃～22℃条件下避光静置培养48小时，再置往复式摇瓶机上振荡培养，振荡频率为80～120次/分，振幅6厘米～10厘米。如果用旋转式摇瓶机，振荡频率为200～220转／分。摇瓶机室温控制在22℃～25℃，冬季室内温度低，可将摇瓶机放入恒温箱内培养。培养时间一般是在5～7天左右。
四、虫草液体菌种的检验方法
虫草液体菌种进行质量检验可采用感官检查、显微镜检查、空白培养基检查和取样测验等方法。
采用电磁搅拌法培养或摇瓶机法培养液体菌种，终止培养后，常用目测法检验，将三角瓶摇晃静止后，如菌丝球均匀地分布于三角瓶中，培养液清澈、无异味，液体中悬浮着大量均匀的小菌丝球，并伴有蛹虫草特有的香味，表示符合质量要求。
简易深层发酵（吹氧）法或发酵罐法大量生产液体菌种，为了更好地控制培养条件，达到优质高产的目的，就需要对培养液中的污染情况、菌丝活力、菌丝体含量、菌丝球数量、PH值、总糖及还原糖、氨基酸、溶氧系数等的变化进行检测。现将有关的检测方法介绍如下。
（一） 感官检查。可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。
看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液（培养液）一般呈白色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种的不同或菌种见光程度而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。醪液变混，有两种可能性，一是细菌污染应予以淘汰；二是由于菌丝生长粘稠过大所致。若难以判断，可进行镜检。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达5.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。
旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。（未完待续）
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