银耳菌种的分离可用耳木分离或组织分离。
一、耳木分离 选子实体大、无杂菌、新鲜的耳棒作分离材料，在长有子实体的部位锯下1厘米厚的木片2-3块，带入接种箱内。木片浸入0.1%升汞溶液中消毒30-60秒钟。用无菌水冲洗，吸干水分后用解剖刀把木片切成小块，随后接入PDA培养基上，每试管一块，置23-25℃下培养。几天后长出白色纤细菌丝，培养基颜色逐渐转黄褐色，直至黑色，同时有淡黄色水珠分泌，如无杂菌则分离成功。挑取少许白色菌丝于PDA培养基上扩大培养，待菌丝不动长满斜面后，选择好的在木悄米糠培养基上作出耳鉴定，从中选出耳率高、生活力强、子实体原基大且成水晶状的作种用。
二、组织分离法 在栽培室内挑选一批朵形大、耳片厚、颜色洁白的作分离材料，用来分离羽毛状菌丝：从瓶或袋的培养基深处取少量木屑，接种在PDA 培养 基上，在25℃下培养，待菌丝长出后，把生长旺盛的菌丝挑出来进行移植 ，便得到纯的羽毛状菌丝。分离银耳菌丝：把留下的分离材料阴干或风干 ，干后把培养 基内的银耳营养菌丝团（俗称耳根）部分置于干燥器中，干燥器底层放浓硫酸或五氧化二磷脱水，经10-20 天后，把菌丝团剥开，在耳根内部挑一点菌种木屑，接种在表面干燥的PDA培养基上，在25℃下培养。经5-10就可以将银耳菌丝分离出来。
三、菌种的组合 先接银耳菌丝，待长到1厘米大小时再接羽毛状菌丝，羽毛状菌丝恢复生长后，就可作为原种的接种材料。原种培养的培养基为木屑78%、米糠20%、石膏和蔗糖各1%，另加水1.2-1.3倍。料拌匀后即可装瓶，塞好棉塞灭菌。将耳木分离或组织分离得到的菌种接入培养基中，室温控制在20-25℃。
银耳栽培有木屑菌种与木块菌种两类。木屑菌种制做与原种制备相同。木块菌种多用于段木栽培，木块有圆柱形和楔形两种。圆柱形菌种：树种枝条有桑、枫、梨、悬铃木、紫穗槐等，截成直径1.2厘米、长1.5厘米的小段，晒干备用。制种时，把干木块浸水12小时左右，并和按木屑 、米糠培养基配方拌好的培养 基拌匀，比例一般为5/1，拌和后装瓶，在料的表面再盖一薄层培养基，按平，塞 棉塞 ，灭菌，接种，培养 。楔形菌种：楔形菌种是将木条加工成高1厘米、宽0.5厘的楔形木块，然后装瓶，接种培养而成。
