（1）配料
参考上述培养基配方，按照廉价易得和节约资源的原则选定原种或栽培种培养基配方。
（2）拌料分装
根据当天的生产计划，按照配方比列称料。先将干料（蔗糖除外）搅拌均匀，然后逐步加水（蔗糖溶于水中）继续搅拌，至培养基含水量达到要求时，即可分装。为了保证菌种质量，生产原种（二级种）当用无色或浅色透明的750毫升菌种瓶作为菌种容器。生产灵芝栽培种（三级种）可用15厘米*30厘米*0.055毫米（长*宽*厚度）的PE袋（适于常压灭菌）或者PP袋（可以高压灭菌）作为菌种容器。
装瓶时，一边将料灌入瓶中，一边用手捏着瓶颈不断振动，直至将料装至瓶口。用扁形铁钩将表面扒平，压紧到瓶肩处。如装塑料袋则应用力均匀，轻拿轻放，避免塑料袋破损。培养料应上面稍紧，下面稍松，松紧度适当。过紧瓶内空气少，影响菌丝生长，过松虽然发菌快，但菌丝少，且易干缩。洗去瓶口内外残留木屑、麦麸等培养料，稍干后塞上棉塞，或用聚丙烯薄膜和牛皮纸包扎瓶口。料袋可用塑料圈加透气塑料盖封口，或者用封口机封口（类似火腿肠封口技术）。装好料的瓶（袋）称为料瓶（料袋）。
（3）灭菌
将料瓶（袋）装入灭菌锅内，灭菌方法有两种：一是高压蒸汽灭菌，二是常压蒸汽灭菌。少量原种、栽培种可以用手提式灭菌锅灭菌，但每次只能灭菌10瓶左右，如果生产大量的原种、栽培种，就要用大型灭菌锅灭菌。常压蒸汽灭菌污染率较高，生产菌种最好使用高压灭菌锅(具体灭菌方法操作，可参考灵芝养生网)。
（4）冷却
灭菌后的料瓶（袋）既可以在专用冷却室内冷却，也可以在接种室内冷却。冷却场地必须提前24小时进行消毒处理。当培养料温度下降至30°以下（明显低于手心温度时），方可进行接种。而接种之前应进行无菌培养试验，检测灭菌效果。
（5）接种
按照无菌操作要求，将母种或原种移接到经过灭菌的培养基上，称为接种。原种和栽培种的接种方法类似，但不同的是原种接入母种，栽培种接入原种。由于打开试管或菌种瓶就可能引起容器内部被环境中其他微生物污染，因此接种的所有操作均应在接种箱（室）或超净工作台进行。接种箱与接种空间应在使用前进行消毒处理。先按每立法米空间用烟雾消毒剂（二氯异氰尿素钠）4克，消毒过夜。在各项接种工作准备完毕后，接种之前4小时，每立方米空间用烟雾消毒剂4克，再进行第二次消毒。在母种接原种时，在无菌条件下，将接种针放在火焰上方充分灼烧、冷却后，在酒精灯火焰附件拔开试管棉塞，钩取一小块带培养基母种，可将母种斜面横切成6-8段，弃去先端，其余每段连同培养基一起接入原种培养基上。
原种移接栽培种时，在无菌条件下，将扁形接种钩或接种铲在火焰上方充分灼烧、冷却后，在酒精灯火焰附件拔开试管棉塞，先弃去原种靠近瓶口3厘米左右的表层原种以减少栽培种的杂菌污染。再将适量下层菌种移接到栽培种培养料的表面，一瓶原种可以转接栽培种50-60瓶。
虽然料瓶（袋）经过蒸汽灭菌，但是在搬取过程中，瓶（袋）壁上会沾染杂菌，一旦接种时打开料瓶（袋），空气气流和操作人员呼吸气流会传染杂菌，使粘在瓶壁上的杂菌污染料瓶（袋）。因此在接种时要严格无菌操作，接种操作规范、利索，才可能降低污染率，降低成本。当培养料接种后，塞上棉塞或盖上瓶盖，移至恒温室或培养室培养。
（6）培养
原种及栽培种接种后置于培养室培养、将接好种的菌瓶（袋）移至恒温室或培养室培养，移动前打扫培养室，保持环境整洁，并提前要消毒处理才能移入菌瓶（袋）。维持培养室温度在25°C左右，空气相对湿度为60-70%。避光，坚强通风换气。菌种培养前期，每2-3天严格检查一次，菌丝覆盖培养基表面后，每隔7-10天检查一次。如在瓶壁、聊面或接种块发现红、绿、黄、黑色等孢子，说明有红色链孢霉、青霉、曲霉或根霉等杂菌污染，应予以淘汰，如检查时间间隔过长，杂菌菌落可能被生长旺盛的食用菌菌丝体掩盖，造成隐形污染。塑料袋制种因体积大，在培养架上放置时切勿挤压，且不宜翻动太频繁，以免菌丝损伤或塑料袋破损。培养室内的培养架之间用木条相互支撑，以免发生倾倒事故。
在适宜环境条件下，一般经过20-40天的培养，菌丝即可扩展蔓延至整个培养料，再经过7-10天的培养，即可用于转接栽培种或用于生产。制备的菌种如果暂时不用，可在凉爽干燥、通风、避光、清洁的室内短期存放，以确保菌种的质量。即使是低温条件下保存，也不宜存放太久，以防菌种老化而活力下降，导致接种后萌发缓慢，而且容易感染杂菌。
