获得银耳菌种的方法主要有担孢子弹射分离法、组织分离法和耳木分离法：
1、孢子弹射法 这是利用新鲜的、成熟的子实体自动弹射出担孢子来获得纯菌种的方法。取朵大、色白、无病虫害的新鲜银耳作为种耳。
用无菌水漂洗银耳数次，再用无菌纱布或吸水纸，把银耳表面的水分吸干。因为耳片表面若有薄水层，便会影响银耳担孢子的弹射，并容易污染上杂菌。再把种耳切一小块，以放入三角瓶或放入试管中不会碰到瓶壁或管壁为度，随后用不锈钢小钩钩住小耳片，迅速悬挂在三角瓶或试管内，同时注意勿使种耳碰到培养基表面，以防污染杂菌，塞上棉塞，然后放在20-25℃条件下，经24小时，从耳片上弹射出来的担孢子，落在光滑的培养基表面上形成一个雾状的孢子印。此时，在无菌箱或无菌室中，将悬于瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20-25℃的室中培养，经2-3天，培养基表面就会出现许多乳白色、糊状的小菌落。此系银耳的酵母状分生孢子。当培养基上出现酵母状分生孢子的菌落时，为了防止和减少污染，应尽快地进行提纯，即挑取少许没有杂菌的银耳酵母状分生孢子，移入新的试管中进行培养。不管银耳担孢子或酵母状分生孢子都不容易萌发成菌丝，所以直接用于生产时有困难，目前已较少采用。不过，为了获得银耳有性繁殖的后代，必须采用担孢子分离法，并使之萌发成单核菌丝，然后进行配对实验。
2、组织分离法
和香菇、平菇不同，银耳组织分离法比较难操作，实用意义也不大。因为耳片一旦胶质化之后，就不容易再长出菌丝，况且段木种植的或野生的银耳，暴露在外界的生长时间很长，耳片上必定会附着各种杂菌，组织分离时既不容易把附着的杂菌洗掉，又不容易用药品进行表面的灭菌处理，且容易导致银耳和条菌同归于尽。只有位于树皮和木质部之间的肥厚的耳基比较容易进行组织分离，可以获得银耳的纯菌丝。不过用耳基分离来的银耳纯菌丝常是鹅黄色的或橙黄色的，不是纯白的，菌丝生长的速度也比较慢，效果也不太理想。
3、耳木分离法 利用长了银耳子实体的段木（简称耳木）来进行分离，是目前获得有实用价值的银耳菌种最主要的方法。
耳木分离法的主要技术是排除耳木中杂菌的干扰，防止分离时污染杂菌，必须把银耳菌丝和香灰菌丝单独分离出来。对初学者来说，耳木分离法是不容易掌握的，必须反复练习，直到掌握分离的要领。耳木分离法的主要步骤如下：
①、耳木选择
在长第一、二批银耳时，取长耳最多，质量最好（尤其是片宽、色白）,杂菌最少的耳木一小段，作为分离材料。分离材料经风干，并用熏蒸剂驱虫（特别是螨）后，移入无菌箱或无菌室中进行分离。
②、耳木灭菌
先把耳木锯成2-4cm厚的木轮，然后去掉树皮、耳基，放入接种箱（室）中，耳木表面用0.1%升汞水或70%酒精揩擦灭菌。技术熟练者也可以不经表面灭菌，就进行分离。
③、耳木取种
通过耳基着生处把耳木纵切成两瓣。然后，在耳基着生处的正下方木材内部剃取极小的木屑粉末（不能用小木片，接种块越小，得到银耳纯菌种的机会越大，接种块越大得到香灰菌丝，或香灰菌丝夹杂一点银耳菌丝的机会越多）,接种在试管中的培养基表面。接种后，把试管放在20-28℃的室温下培养，数天之后接种块的周围就开始长出菌丝来。
④、分离结果 由于分离的技巧不同，分离的结果也不一样。大致可以得到如下几种结果：
只得到银耳菌丝；只得到香灰菌丝；同时得到银耳菌丝和香灰菌丝，但香灰菌丝占绝对多数；得到银耳酵母状分生孢子和香灰菌丝。如果有杂菌干扰，分离的结果就更复杂了。
为了获得有生产价值的银耳菌种，在分离后的第3-7天内要天天观察，把银耳菌丝和香灰菌丝单独分离出来。
