母种的制作
1、培养基配方
①、黄豆芽500克（煮汁），白糖20克，琼脂20克，羊肚菌基脚～50克，水1升。
②、黄豆芽500克（煮汁），白糖20克，琼脂20克，水1升。
③、栎木屑500克（煮汁），白糖20克，琼脂20克，水1升。
④、马铃薯200克（煮汁），白糖20克，琼脂20克，蛋白胨0.5克，牛肉膏0.5克，水1升。
⑤、蛋白胨1克，葡萄糖20克，琼脂20克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克，维生素B1，1克，水1升。pH值自然。
上述配方任选一组。将木屑或豆芽加水1升煮30分钟，过滤取汁，并将余下的水补足1升，加入其它原料，煮至溶化后，按母种制作常规方法，分装于18毫米×180毫米或20毫米×200毫米试管的1/5，塞上棉塞，使用高压灭菌锅彻底灭菌；在0.68千克压力下维持60分钟，自然冷却至指针回到原位才可打开，放成斜面备用。
2、菌种分离
首先要具有食用菌专业基础知识、多年的菌种分离经验及菌丝鉴别能力，其次要购置母种培养基、无菌接种箱、恒温培养箱、冰箱、高倍显微镜等必要设备。根据当地羊肚菌生长季节，趁羊肚菌生长旺盛时做菌种分离工作。
①、分离方法
羊肚菌的分离方法与其它食用菌大不相同。它需要一种助生菌与羊肚菌菌丝共生时才能出菇。这种助生菌长期活动在土壤中，有时以芽孢菌形式出现，有时以菌丝形式出现。它为羊肚菌的原基形成和子实体生长发育起着至关重要的作用。因此，从土壤中分离该菌比其它任何方式分离要好些。但从土壤分离难度太大，成功率不到万分之一，并且难以分辨，所以只有采取羊肚菌基脚土分离，才能真正找到羊肚菌的出菇菌丝。初学者可在四川绵阳市食用菌研究所购买培养好的羊肚菌优良母种，并参加现场培训。
②、操作过程
在羊肚菌生长的周围，可见白色菌丝充满土壤。从土壤中挑选这种菌丝容易成功。现介绍两种土壤分离的简易方法：一种是土壤直接分离，另一种是浸提分离。土壤直接分离法：在羊肚菌生长的地方去掉羊肚菌，取周围5厘米以内的土壤，去掉表层，把土壤放入无菌接种箱内，然后放入试管培养基，进行接种箱空间消毒。即按接种箱每立方米空间用甲醛10毫升，高锰酸钾5克，混合产生气体消毒，半小时后才可操作。将基脚土用接种针挑取黄豆大小一块，迅速放到试管内的空白培养基上，每管放一块，塞上棉塞，接种后取出培养。浸提分离法：将基脚土用无菌水稀释，澄清后用接种针蘸取少量溶液，滴到试管内的空白培养基上，塞上棉塞后取出培养。
分离后，放在12～18℃温度下培养观察。3天后培养基上萌发菌丝，每天仔细检查每支试管的发菌及变化情况。区分和认识各类杂菌是最关键的核心技术。真正的羊肚菌菌丝最初为灰白色，生长很快，时间长会变成棕黄色，有时会出现菌核，母种7天长满试管，原种、栽培种15天可长满瓶底。是否分离成功，必须做栽培出菇试验，待出菇后才能准确认定是否羊肚菌的菌种。一旦菌种分离成功，在以后的转接过程中要小心，不能再让杂菌感染，必须把好高温灭菌关和接种消毒关，才能保证菌种质量和成活率。
3、转接提纯
待培养基表面余水干后才能使用，否则会被细菌感染。接种要求在接种箱内通过药物灭菌进行，将第一代纯母种挑取黄豆大一块带菌丝的培养基，放入空白培养基上，每支母种可接10～15支，母种只能扩种一次，不能多接或多扩，否则会影响子实体生长。
