硒是人体的必需微量元素，是GPx(谷胱甘肽过氧化物酶)家族、ID(脱碘酶)家族、硒蛋白P、硒蛋白w的重要组成部分，在人体发挥着重要的生理功能。现已证明人体的克山病、大骨节病、癌症、肿瘤、机体免疫力减退、心脑血管疾病、糖尿病、不育症、爱滋病、白内障…等多种疾病均与体内缺硒相关。硒不能在人体内合成，必须从体外摄入”，研究表明，无机硒(如硒酸盐、亚硒酸盐)均为有毒，其使用范围和剂量都受到限制；有机硒化合物属无毒或低毒，且生物利用率高，因此，有机硒成为人体补硒的首选”。 灵芝则是我国中药和传统食疗宝库中的珍品，具有广泛的药理活性”’，食补、药用的历史已有两千多年。利用灵芝作为富硒的载体，将无机硒转化为在毒理安全性、生理活性和吸收率上更优越的有机硒”’，发挥硒和灵芝固有的以及协同的生理作用，具有重要的意义。 研究从15种灵芝中有针对性的进行富硒能力的比较试验，从中选择富硒能力强的菌株，为富硒灵芝的栽培及液体发酵生产提供了参考。1材料与方法1．1 灵芝菌种 泰山灵芝(1号)、韩国灵芝(2号)、信州灵芝(3号)、G6(4号)、日本红芝(5号)、日本平芝(6号)、美围大灵芝(7号)、京大灵芝(8号)、甜芝(9号)、G—F，(10号)、(；902(11号)、G3(12号)、惠州灵芝(1 3号)、G8(14号)、G11(15号)，分别引自山东金乡食用真菌研究所、华中农业大学、江苏省食用菌菌种保藏中心等。1．2供试培养基①PDA同体培养基：马铃薯汁20％，葡萄糖2v／／，K：HP0。0.1％，硫酸镁0.05％。琼脂2％，加水l 000mL。②种子培养基：马铃薯提取液20~A，，葡萄糖2％，蛋白胨l％，酵母提取物1％，磷酸二氢钾(K：HPO。)0．1％，硫酸镁0．05％，，VB．10 mg／kg，pH 7.0，水1 000 mL。③液体发酵培养基：蔗糖2％，玉米粉2％，豆饼粉2％，磷酸二氢钾(KH：P0。)0．1％，硫酸镁O．05％，VB，l0 mg／kg，pH 70，水l 000 mL。1．3试验方法1_3．1 PDA平板培养基耐硒试验 将不同灵芝菌株接种于含Na~一SeC)，浓度分别为0％、O．05％、O．2％、O．5％的PDA平板培养基上，28℃避光培养，待菌丝萌发后，每天观察和测量菌丝的生长情况和生长速度。1 3．2液体摇瓶培养灵芝富硒能力比较试验将灵芝菌株接种于种子培养液中，28℃，转速140 r／min旋转式摇床，堵养7 d。 将种子液5％的接种量接种于含亚硒酸钠的浓度分别为O％、O．05％、0．20／i、0．5％的发酵培养基中，28℃，转速140 r／min旋转式摇床，培养7 d，测定富硒灵芝菌丝体中硒的含量。1．3 3 分析方法1．3．3．1 生物量测定采用干重法 发酵液经4 000 r／rain离心15 min去除上清液，菌丝体用去离子水洗涤3次后离心，置于烘箱内60℃烘干24 h。1．3_3．2硒含量测定样品处理，取烘干至恒重的菌丝体O．1 g，加10 mL 95％浓硫酸，待样品湿润后，再加20 mL混合酸液，加热，温度控制．300℃左右，维持30min左右，使溶液呈无色，取出冷却后定容到50 mL。硒的测定：经混合酸消化后的样品与DAN，在酸性溶液(pH l~2)中反应生成4，5一苯并苤硒脑，用环己烷丕硒脑莘取出，于荧光分光光度计上，用激发光波长376 nm，发射光波长520 nin处测定丕硒脑的荧光强度(参照GBl 3015—19)。 总富硒量(斗g，L)菌丝体生物量(g，L)×菌丝体中的硒含量(LLg／g)2结果与分析2．1 不同灵芝菌株在含Na。SeO。的PDA平板培养基上的生长情况结果如图1。 从下图1可以看出，在不含亚硒酸钠的培养基上菌丝的生长速度均明显高于含亚硒酸钠的培养基上菌丝的生长速度，在500～5 000 mg／kg范围内，不同浓度的亚硒酸钠对灵芝菌丝的生长均具有不同程度的抑制作用，并且这种抑制作用随着亚硒酸钠浓度的增高而增强，亚硒酸钠的浓度越高，灵芝菌丝的生长速度越慢。13号、14号和7号菌株生长速度较快，特别是13号(惠州赤芝品种)，其在含亚硒酸钠的PDA培养基上生长速度最快，分别为0.79 cm／d，0.66 cm／d和0．58 m／d，而且通过试验观察发现惠州亦芝菌株在含亚硒酸钠培养基上菌丝具有萌发时间较早，菌丝较为粗壮的特征。因此可以认为其对亚硒酸钠相对于其它灵芝菌株具有较好的耐受能力。2_2不同菌株液体培养过程中富硒能力的比较从图2可以看H，在灵芝液体培养基中添加100 mg／kg、300 mg／k g、500 mg／kg的亚硒酸钠，以不添加亚硒酸钠的液体培养基作为对照，试验结果表明在添加100～500 mg／kg亚硒酸钠比对照菌丝体生物产量均有降低，而且亚硒酸钠浓度越高，生物产 从图3可以看出，在灵芝液体培养基中添加100、300、500mg／kg的亚硒酸钠进行培养，以不添加亚硒酸钠的液体培养基作为对照，在添加相同浓度的亚硒酸钠后，8号、l0和14有机硒含量分别为3。784．2斗g／100 mL和3 162．5斗g，100mL。 综上，可以看出在相同条件下，13号菌株即惠州赤芝较其他灵芝菌株对亚硒酸钠具有较好的耐受能力，在液体培养时，其菌丝体生长情况最好，富硒能力最强，在100mL液体培养基中添加300 mg／kg浓度的亚硒酸钠培养后，其最终菌丝体的有机硒的含量约为3 784．2阻g。3讨 论 灵芝的富硒培养目前是灵芝研究的一个热点，目前一般通过两种方法制备富硒灵芝。一是人工栽培生产富硒灵芝子实体，二是液体发酵生产富硒灵芝菌丝体。两种方法均通过在培养基中添加亚硒酸钠，利用灵芝自身的生长代谢过程来将无机硒转化为有机硒，并自然地达到一定程度的生物富集”。在研究中发现，灵芝对硒有一定的耐受性，而且富集的硒的浓度在一定范围内，随培养基中的亚硒酸钠浓度增加而增加，但得到的产量却有可能受到影响。在灵芝富硒的过程中，应综合考虑产量、富硒水平、人体的每日需要量和产品的量越低。在供试灵芝菌株中，7号菌株和13号菌株的生物产量较高，在添加300 mg／kg的亚硒酸钠后发酵最后其生物量分别达到1.478 g／100 mL和1.586 g，100 mL。因此，可以认为在相同条件下，亚硒酸钠对7号和13号菌株液体培养时生物量的比其它菌株的影响小。号菌株液体培养后菌丝体中有机硒的含量较高，其中尤以13号菌株最高，在添加300 mg／kg和500 mg／kg亚硒酸钠时，其菌丝体有机硒含量分别达到2：386斗g／g和2 618g／g，经计算总最终定位等方面的因素，以求硒的转化更经济有效。研究比较了不同灵芝富硒能力的差异，为灵芝的富硒栽培和液体富硒发酵生产作了有意义的尝试准备工作。灵芝富硒的能力与硒的浓度、培养的配方组成、液体发酵时的温度、pH值、溶氧参数等息息相关，这些参数对硒的转化率的影响有待于进一步的深入研究。
