该法是采用采用成熟的担孢子萌发培养成菌丝体而得到纯菌种的方法。担孢子具备亲本的遗传特性，但变异的机会多，生命力强，可能选育出优良的菌株。“种茹”的选择要求与组织分离法一样，但成熟度要求八九分成熟的金针茹子实体，因为这时的孢子萌发力强，数量多，分离之后可供挑选的机会多。孢子分离法有单孢分离与多孢分离两种方法，驯化育种采用的是多孢子分离法，该法又分为“种茹”孢子弹射法和菌褶贴管壁法两种。
(1)“种茹”孢子弹射法：取“种茹”切去菌柄，表面用70%的酒精擦洗干净或浸入0.1%的升汞水中1~2min，无菌水冲洗数遍后，用滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内按无菌操作规程将“种茹”的菌褶朝下，用铁丝支撑置于培养皿上，放在消毒擦洗过和大型钟罩下，把灭菌过的滤纸置于培养皿容器内。整个装置要让之通气，否则罩内湿度过大，孢子反而不易落下。经过12~20h，就可以看到在培养皿内或滤纸上散落一层白色的孢子印。用无菌接种环沾取少量的孢子，置于盛有无菌生理盐水的大试管或三角烧瓶中稀释，制成孢子悬浮液，再用无菌的注射针筒或滴管，吸取孢子悬浮液，注入1~2滴孢子液于培养基表面，并用无菌接种环涂布培养，待孢子萌发后挑取孢子萌发早、长势好的菌落进行转管培养。
(2)菌褶贴管壁法：钩取一块干净、发育良好的金针茹菌褶，在无菌操作条件下，贴在斜面培养基上方的试管内壁上，为了让之贴牢，可加1~2滴无菌水在试管壁上。放好菌褶后，塞入棉塞，置于适温条件下培养。待看到培养基上产生与菌褶相应大小的雾状物时，立即将附在试管壁上的菌褶片在无菌条件下取出。待长成肉眼可见的菌丝时，挑取并放入新的试管培养基中进行培养。
孢子分离污染率较高，要剔除肉眼可见的各种杂菌。之后，挑取的各菌株一定要经过出茹试验来鉴定是否是优良的驯化菌株。
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