食用菌母种主要采用人工选择、诱变育种、杂交育种和原生质融合等手段获得。作为一般制种专业户，可以采用人工选择方式分离培育母种，具体步骤与操作方法如下。
1、采集种源 从野生成人工栽培群体中，选择有代表性的优良菇体作为种源。种菇的标准是：八成熟，朵形圆正、肉质肥厚，无病虫害。采集1—2朵符合上述标准的种菇编上号码，作为分离母种的材料。从栽培室采集的应标有原菌株代号。
2、培养基配制 琼脂培养基又叫PDA培养基，常用配方为：马铃薯200—250克，琼脂15—20克，葡萄糖20—25克，清水1000毫升。也可以加硫酸镁1—1.5克，维生素B1微量，磷酸二氢钾2—3克。先将马铃薯洗净去皮，切成薄片，置于铝锅内加水煮沸30分钟，捞起后用4层纱布过滤，取汁。然后将琼脂加入汁内，边加热边搅拌，让琼脂充分溶化；再将葡萄糖等加入，稍煮几分钟后，同样用4层纱布过滤，取其汁液，将汁液趁热装入玻璃试管内。装至管长的1／5，管口用棉花塞紧，或将汁液装入玻璃三角瓶内，装量20毫升。然后置于高压锅内，在98—108千帕／厘米的压力下灭菌30分钟左右。灭菌后及时取出，趁热将试管斜排于桌上，冷却后即成为固体斜面培养基。
3、母种分离方法 有孢子弹射、组织分离和基内分离3种方法。①孢子弹射法。将种菇表面消毒，吸干水分后，将菇体悬挂于装有琼脂培养基的三角瓶内，让菇体内的袍子自然散落在培养基上萌发菌丝。也可以剪取一小决菇体，贴附在试管斜面培养基表面，让孢子散落在培养基上萌发菌丝，即能获得母种；②组织分离法。将消毒过的种菇，在接种箱内用手从菇柄处对半解开，或用刀片切开，使菇体形成对开。在菌盖和菌柄交界处或菌褶处，用接种刀切取一小块菇体，然后纵切成5×10毫米的小薄片，用接种针挑取一块薄片，接入斜面培养基的中央，每支试管接种一小块薄片，待其萌发菌丝，即可得到母种；③基内分离法。选择已长菇的木段，削去树皮及表层木质部，用70％的酒精消毒后，锯成1厘米厚的薄片，放入0.1％的升汞水中消毒1—2分钟，再用灭菌水洗去残液。然后再将小薄片劈成0.5—1厘米宽的小条，接入斜面培养基中央，待长出菌丝后即得母种。也可以在已长菇的菌袋中，经消毒处理后，用接种针钩取袋内色泽纯、长势旺的菌丝体，接种在试管斜面培养基中央，待萌发菌丝后，同样获得菌种。
4、适温培养 通过上述不同方式将菌种分离接种于试管后，要及时将试管移入已消毒的培养箱或培养室内培养，温度控制在25℃左右，使分离获得的孢子或菌丝在适温下发育。一般孢子弹射3—4天后孢子萌发成菌落，10天后菌丝长满管；组织分离接种后2—3天，菌丝即萌发，并在培养基上蔓延生长；菇木分离接种后，7天菌丝即恢复生长。
5、选育提纯 通过上述方法得到的菌丝，不一定都是优质的，还需要选育提纯。因此，在菌丝萌发后，要认真观察，挑选色泽纯、健壮、长势正常、无间断的菌丝，在接种箱内连同培养基钩取菌丝，接入另备的试管培养基上。在23—25℃的恒温条件下，培养7—10天，待菌丝长满管后，再进行观察，从中择优取用，即为“母代”母种。
6、转管扩接 母代母种可以转管扩接成“子代”母种。采用同样的斜面培养基，每支可扩接30—50支子代母种。生产上供应的多为子代母种。它可以再次转管扩接。一般每支可扩接成20—25支子代母种，但转管次数不得超过5次。
7、出菇试验 分离选育的母种，还必须进行出菇试验。方法是：把母种接种于瓶或袋装的木屑培养基上，根据各种菇耳种性对温度的要求，进行适温培养，直至出菇才证实可用于生产。
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