食用菌栽培种植 | 食用菌遗传育种及种质鉴定研究进展

1食用菌遗传育种技术

1.1人工选择育种

人工选择育种是指利用生物在自然界的自然选择规律，用人工的方法定向选择自然条件下发生的有益变异，使有益变异不断累积并遗传，以获得人类需要的新品种的过程。“北京猴头菌1号”(陈文良，1988)、新疆白阿魏菇Pleurotus nebrodensis(Inz.)Quél.(贾身茂、秦森，2006)、开化木耳(沈秀法，2002)等新品种，都是通过人工选择获得的。人工选择的基本方法是利用组织分离法和孢子分离法获得纯菌种，不断纯化得到优良菌株。为了使人工选择育种产生效果，必须全面系统地对我国丰富的食用菌野生资源、栽培品种进行调查、采集、分离、保藏和种性(包括外部形态、生理习性、营养价值、遗传特性)研究。

1.2诱变育种

诱变育种是利用物理(包括非电离辐射类的紫外线、激光、离子柱和引起电离辐射的x射线、γ射线和快中子等)和化学诱变剂(烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物)处理细胞群体，显著提高其基因突变，进而从差异群体中挑选出符合育种目的的突变株。诱变育种具有速度快、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。

1.2.1紫外诱变

紫外诱变育种是较为简单的一种诱变育种方式，其最适宜的诱变对象是单细胞、单核个体。李德舜等(2002)利用紫外诱变处理平菇“山大1号”菌株的担孢子获得了理想的新品系。此外，通过对特定的菌丝原生质体的紫外诱变，也获得了稳定性较好，生物量较高的姬松茸Agaricus blazei Murrill(张卉等，2004)、灰树花Grifola frondosa(Fr.)S.F.Gray(徐志祥等，2004)、猴头Hericium spp.(李艳红、李莉，2006)等的诱变菌株。

1.2.2辐射育种

辐射育种是利用γ射线等射线诱发作物基因突变，获得有价值的新突变体，从而育成优良品种。夏志兰等(2004)采用60Co-γ射线诱变杏鲍菇Pleurotus eryngii(DC.exFr.)Quél.菌丝，经过拮抗试验和酯酶同功酶电泳验证，选育出一株杏鲍菇新菌株，用该方法选育出的姬松茸新菌株，经液体培养其胞外多糖产量较出发菌株提高12%(张卉、佟俊生，2003)。

1.2.3激光诱变

激光诱变育种是上世纪60年代在前苏联兴起的一种育种技术，其原理是利用激光作用于生物体时产生的压力、热效应、电磁效应及其综合效应引起生物大分子的变化，进而导致遗传变异。激光诱变育种作为现代农作物育种技术的一项高新技术(李万云、李韬，2006)，由于其具有正变率高、遗传稳定性好的特点而被应用于食用菌育种研究中。目前应用He-Ne激光诱变已经获得了具有良好遗传稳性香菇菌株(张小里等，2000)和金针菇SOD高产株(李耀维等，2002)。

1.2.4离子注入

离子注入诱变是利用离子注入设备产生高能离子束并注入生物体引起遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。目前这项技术在我国食用菌的育种中应用较少，付永前等(2005)尝试用低能离子束诱变选育阿魏菇Pleurotus ferulae Lenzi多糖高产菌株，获得初步结果。

1.2.5空间诱变

空间诱变育种是指利用返回式卫星或高空气球将农作物种子带到太空，在太空特殊的环境(空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素)作用下引起生物染色体畸变，进而导致生物体遗传变异，经地面种植选育新种质、新材料，培育新品种的作物育种新技术。目前我国已经进行了香菇、平菇、黑木耳、金针菇、灵芝等食用菌的空间诱变试验(贾建航、边银丙，1998)。

诱变育种中出发菌株的选择、诱变对象所处的状态、诱变剂的使用及剂量都会影响诱变效果。一般来讲，选择经自然选育并应用于生产、性状稳定、综合性状优良而仅有个别缺点的菌株，使其处于单细胞的均匀悬浮液状态并根据食用菌的辐射敏感性和各种性状，在不同剂量下的突变频率确定诱变剂的剂量，从而达到理想的诱变效果。

1.3杂交育种

杂交育种技术是食用菌新品种选育中使用最广泛、收效最显著的育种手段。其原理是通过单倍体交配实现基因重组，从杂交后代中选育出具有双亲优良性状的菌株。20世纪80年代后，杂交育种技术在我国食用菌育种研究中广泛应用。我国香菇生产中90%以上的菌种都来源于单孢杂交育种(谭琦等，2000)。最近，通过单孢子杂交又获得了双孢蘑菇(贺建超等，2006)的优良高产菌株。此外，为克服金针菇Flammulina velutipes Curt.：Fr.(Sing.)产生的无性孢子对有性杂交的干扰，研究人员采用多孢杂交技术培育出了金针菇主栽品种“杂交19”等(郭美英，1993)。

杂交育种要判断杂种的真实性，亲代必须有标记，异宗配合的种类，由于自交不亲和，因此亲本的性别本身可作为标记，目前食用菌杂交育种也多适用于异宗配合种类。

1.4原生质体融合育种技术

食用菌的遗传背景复杂，加上常规育种手段本身存在局限性，越来越不能满足人们对新品种的需要，基于细胞工程发展起来的原生质体融合技术，是作物及食用菌遗传育种手段的重大突破。该技术是将不同遗传类型的原生质体，在融合剂(或电场)的诱导下进行融合，实现部分或整套基因组的交换与重组，从而产生新品种的过程。由于原生质体融合育种是一种不通过有性生活史而达到遗传重组或有性杂交的育种手段，与常规的杂交育种手段相比，受亲缘关系的影响较小，使遗传差距较大的远缘种间、属间甚至科间以上的杂交成为可能。

20世纪70年代，裂褶菌原生质体的成功制备，使得应用原生质体融合技术进行食用菌育种成为可能(DeVries、Wessels，1972)。Zhao et al.(1995)利用PEG法和电融合法获得了Coprinus cinereus和Schizophyllum commune种内不同菌株间的融合子，但是随后进行草菇属Volvariella种间原生质融合实验，AP-PCR鉴定融合子未发现双倍体现象(Zhao et al.，1997)。在我国，潘迎捷等(1991)获得了香菇种内原生质体融合菌株，随后研究人员在平菇属和香菇属间(刘振岳、赵世民，1991)、蘑菇属和口蘑属间(张功等，2005)进行原生质融合育种实验，取得了一定的效果。值得一提的是肖在勤等(1998)用该方法，获得了金针菇和凤尾菇不同科间的具有双亲优良性状的融合菌株“金风2-1”，并用于生产。目前研究人员也努力用原生质体融合技术试图解决难栽培，市场需求量很大的外生菌根真菌松茸的育种(王淑珍等，2003)。

原生质体融合育种的困难就是融合子的鉴定问题。可以用于融合子鉴定的标记有形态标记如有无锁状联合、同功酶分析、生长拮抗试验、出菇实验及担孢子分析。然而锁状联合只是被发现在一些融合率很低的种间融合子(Toyomasu & Mon，1989)，而在种内的2个不亲和的单核亲本的融合子不一定产生锁状联合(林芳灿，1991)；同功酶分析要依靠生化位点的建立，耗时而且受生理环境的影响；出菇实验是鉴定融合子最好的证据，但是也不排除单核子实体；原生质体单核化可以为鉴定融合子提供一条途径，但是过程复杂(Zhao & Chang，1993)。因此，应用原生质融合育种技术尚需找到更可靠的鉴定融合子的方法。

1.5基因工程育种(转基因育种)

基因工程育种技术是指人为从某一供体生物中提取所需要的目的基因，在离体条件下用适当的酶切割或修饰，然后将其与载体DNA分子连接起来一并导入受体细胞中进行复制和表达，从而选育出新物种。它为食用菌，尤其是为那些常规育种手段受到限制的种类育种开创了新的途径。

遗传转化和表达系统的建立是基因工程育种的一个重要环节。1986年Mufioz-Rivas等利用PEG法把同源的trpC基因转入裂褶菌色氨酸营养缺陷型突变株中，获得正常的裂褶菌菌株，这为后来的食用菌遗传转化育种奠定了基础。但是随后进行的大肠杆菌潮霉素B转磷酸酶标记基因(hpt)在双孢蘑菇中的转化受到了严重的甲基化(Mooibroek et al.，1990)。研究人员用PEG法、电激法、基因枪法等各种方法，介导外源DNA到双孢蘑菇原生质体、菌丝、子实体中试图建立一个稳定的转化体系，但都因为供体DNA进入受体后不稳定、重组率低、甲基化严重或者在异源启动子作用下不能充分表达而没有成功(Challen et al.，1991；Royer et al.，1991；Li et al.，1993)。1996年，Van de Rhee et al.通过电融合法将大肠杆菌抗潮霉素基因转入腺嘌呤营养缺陷型的双孢蘑菇同核体菌株中，成功地获得了稳定的双孢蘑菇转化体系。但是这个转化体系对异核双孢蘑菇或其它的食用菌转化是否可用，当时存在争议(Stoop & Mooibroek，1999)。1998年，De Groot et al.利用农杆菌(Agrobacterium)介导转化丝状真菌包括双孢蘑菇，结果表明转化效率很低尽管该方法简便易操作。Chen et al.(2000)在前人的基础上对农杆菌介导转化的方法作了修改，通过子实体菌褶组织与农杆菌共培养在同源启动子的作用下实现了双孢蘑菇的高效转化。Leach et al.(2004)利用农杆菌介导大肠杆菌抗潮霉素标记基因转化双孢蘑菇获得较理想的结果，但同时也发现酚、乙酰等诱导的毒性对整合到双孢蘑菇基因组的转化基因有毒害作用。除了双孢蘑菇外，目前仅有少数食用菌包括侧耳(Herzog et al.，995)、香菇(Hirano et al.，2000；闫培生等，2002)、金针菇(Kuo et al.，2004)进行了类似的遗传操作，但还没有建立起相对稳定的转化系统。

2新型种质鉴定技术

在食用菌育种工作中，如何选择和有效的鉴定出符合目标的菌株，以及对优良菌株的保护是非常重要的。传统的鉴定方法是依靠菌株的形态、生理、生化等特征，然而很多时候形态特征不明显(出菇实验耗时)或受环境影响不可靠，因为没有统一的鉴定标准，给下游的栽培带来选择困难。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映分子标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。与以往的遗传标记相比，分子标记具有独特的优越性：大多数分子标记是共显性遗传，对隐性农艺性状的选择十分便利；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；而且基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的(马富英、罗信昌，2002)。随着分子生物学技术的发展，目前已经发展出了几十种基于DNA多态性的分子标记，如随机扩增多态性(RAPD)、限制性片段长度多态(RFLP)、基于Southern杂交和基于PCR的扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列长度多态性(SSLP)、序列标记位点(STS)、单核苷酸多态性标记(SNP)、特征片段扩增区域(SCAR)、核糖体DNA(rDNA)重复序列等。其中以RFLP、RAPD标记较为广泛地应用于食用菌的菌株的鉴定，遗传多样性、亲缘关系分析、种质资源评估、遗传图谱构建及基因定位和克隆等研究领域中，AFLP的应用也有少量报道。

2.1 RFLP标记

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)即限制性片段长度多态性，其基本原理是生物在长期进化过程中，在属、种乃至品种间同源DNA序列中的某一位点上，由于发生插入、缺失、倒位、易位或单碱基突变等造成该处限制性内切酶识别位点的增加或减少，因而供试菌株DNA经酶切、电泳、Southern杂交会产生不同长度的多态性，显示不同的带型，而这些带型是鉴别品系，分析类缘关系，验证遗传分离的科学证据。

上世纪80年代，该技术就在对栽培蘑菇品系与野生物种间的类缘关系分析中得到很好的应用。Molina et al.(1992)用PCR-RFLP对斗菇Lentinus spp.和香菇Lentinula edodes的18SrDNA和1TS1-5.8SrDNA-ITS2区域进行分析，所有的香菇菌株的限制性图谱相同，而与斗菇的有明显区别，支持将香菇从斗菇属中分出来而独立成香菇属。李英波等(1995)对野生和栽培香菇菌株做了RFLP指纹图谱分析，表明遗传分离普遍存在于菌株间而与地理分布没有很大相关性，提示在育种工作中选择亲本时应根据菌株间的遗传分离，而不是单纯以地理位置的差异来选择亲本。Xu et al.(2002)利用核基因和线粒体基因的RFLP及多位点酶电泳多肽分析了双孢蘑菇自然居群的遗传多样性，指出法国不同分布区的2个双孢蘑菇居群都存在很高的遗传多样性。Bao et al.(2004)利用26SrDNA-RFLP研究来源于亚洲的侧耳属34个菌株，阐述了侧耳属不同生物种间的系统进化关系。张金霞等(2004)以IGS2-RFLP为分子标记，对中国栽培的白灵菇不同品种进行了鉴别。余志晟等(2005)应用RFLP技术对12个草菇栽培菌株的核糖体、线粒体和基因组总DNA的多态性进行了研究，结果表明供试菌株间遗传差异很小，为草菇的育种提供资料。

2.2 RAPD标记

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA，是由Williams和Welsh(1990)发展起来的。它是建立在PCR技术基础上，利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD分子标记以其操作简单、快速、信息量大、经济等优点而被广泛应用于杂交亲本的选择、杂合子或融合子鉴定及遗传相关性分析上。但RAPD随机扩增引物的选择和数量是十分关键的环节，不同的引物或引物选择数量的多少将直接影响分析的结果。

运用RAPD技术对杂合子或融合子与其亲本进行聚类分析和相似系数分析，可以判断杂交或融合是否成功。曾荣、刘组同(1999)应用RAPD技术结合同工酶分析检测到虎纹斗菇Lentinus tigrinus和金针菇Flammulina velutipes属间融合子，而凤尾菇和金针菇科间融合子菌株“金凤2-1”也是用RAPD标记检测出的(肖在勤等，1998)。

Yan & Jiang(2005)将RAPD遗传距离作为选择单核亲本的指标，用于Stropha riarugoso-annulata杂交育种中，并认为根据RAPD遗传距离与杂合子的菌丝生长率的相关性，可以预测杂合子的表型。Mooreet al.(2001)应用RAPD技术分析了26个双孢蘑菇菌株，结果表明来源于6个不同公司的24个菌株间相似性很高，而与2个广泛栽培的菌株间有明显的差异。

Ramírez et al.(2001)对用于栽培的商业化双孢蘑菇的菌株进行了RAPD多态性分析，结果检测到所有分析的菌株间同源性很高，并且选择出了一个与农艺性状“蘑菇重量”相关的DNA标记。Shnyreva et al.(2003)用RAPD标记结合同工酶电泳技术对俄国广泛栽培的侧耳和双孢蘑菇菌株做了分析，结果显示侧耳表现出很高的遗传多样性，而双孢蘑菇不同菌株之间相似性却很高。在我国，张金霞等(2004)以RAPD为分子标记，研究了中国栽培白灵侧耳菌株的遗传多样性，结果显示供试的侧耳菌株间遗传多样性很高。邓旺秋等(2004)利用RAPD标记对广东省8个草菇主栽菌株的亲缘关系和遗传多样性进行研究，获得了草菇不同菌株的DNA指纹图谱，为草菇商业菌株的鉴别提供了快速有效的技术手段，同样的方法也被用于不同木耳菌株的准确鉴定(闫培生等，2000)。

RFLP、RAPD分子标记除用于菌株的鉴别、遗传多样性分析外，还可用于食用菌的遗传连锁图谱的构建、基因定位和克隆以及线粒体遗传等研究。目前应用RFLP、RAPD、rDNA重复序列及同工酶及表型标记已经构建了双孢蘑菇、糙皮侧耳遗传连锁图(Larraya et al.，2000)。最近又得到了二极交配型Pholiota nameko的不亲和性相关蛋白基因(Hox1)的连锁图(Aimi et al.，2005)。

在RAPD、RFLP基础上逐渐发展起来的AFLP、SCAR也开始用于食用菌的品系鉴定(Kazuhisa et al.，2004；吴学谦等，2005)