蛹虫草[Cordyceps militaris(L．)Link]又名北冬虫夏草，是重要的药用真菌，已列入中国药典。在日本、韩国、中国等已将蛹虫草作为冬虫夏草的代用品，应用于药品和保健食品的开发。目前，蛹虫草虽已实现人工栽培，但由于菌种在人工培养基上容易丢失形成子实体的能力，从而影响蛹虫草规模化的人工栽培。蛹虫草无性型菌丝体也含有与有性型子实体同样的生理活性物质及相似的药用价值。因此，可利用发酵生产蛹虫草无性型菌丝体来进行相关产品的开发。但仍面临野生型菌种虫草菌素等生理活性物质含量较低的问题。因而，开展提高蛹虫草无性型菌丝体生理活性物质含量的育种工作就显得十分的必要。现将利用原生质体进行紫外线诱变筛选高产虫草菌素的蛹虫草菌株的研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株及培养基 蛹虫草菌株CM9—26：贵州大学生命科学院真菌资源研究所保存提供，作为紫外线诱变的出发菌株。
菌丝生长及产孢培养基：加富PDA培养基(黄清荣，2005)：马铃薯2009，麸皮50g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04 3g，MgS04 2.5g，维生素B1 0.01g，琼脂20g，水1000mL；原生质体再生培养基：含0.6mol／L蔗糖的PDA培养基；固体发酵培养基：大米25g，玉米粉0.4g，葡萄糖10g，蛋白胨59；营养液：硫酸镁1.09，磷酸二氢钾29，柠檬酸铵1g，水1000mL。1:1.6加入营养液。
1.2 药品、试剂和仪器 Alhec h高压液相色谱仪：美国AUtech公司；ellulase(from Trichoderma Viride)购自Solarbio公司(日本)；虫草菌素和腺苷标样购自Sigma公司(美国)；大米：市售；其余试剂为国产分析纯。
裂解酶液：O.8mol／L MgSO4为渗透压稳定剂，配制含1%cellulase的酶解液，用以制备原生质体。
1.3 原生质体的制备与再生 菌株CM9—26在PDA培养基上25℃恒温培养7～10d，收集孢子并制备成均一的孢子悬液(1xll8个／mL)。取200uL涂布铺有玻璃纸的PDA平板，25℃培养65h，收集菌丝体。取300mg湿菌丝体加30mL裂解酶液，25℃，60r／min酶解2h。将原生质体液过滤，取滤液，3200r／min离心10min，弃上清，预冷0.8mol／L MgSO4溶液重悬沉淀，3200r／min再离心10min。原生质体沉淀重悬于0.8mol／L MgS04，终浓度106个／mL。
取200ml原生质体液涂布双层再生培养基平板(底层为菌丝生长培养基，顶层为再生培养基)，25℃培养4—5d。
1.4 原生质体的紫外线诱变处理 照射前，先打开石英紫外光管预热30min。取5mL浓度为106个，mL原生质体液于无菌的直径9cm平皿中，磁力搅拌，距离紫外灯30cm，分别照射0s，10s，30s，50s，70s，90s，110s，140s，170s，200s，230s，300s。在黑暗中完成照射过程，红灯下操作。每一照射取1mL适当稀释后取0.1mL涂布原生质体再生平板。25℃黑暗培养50d，计数，绘制紫外线诱变致死曲线。每处理3平行。
1.5 固体发酵 将野生菌株和诱变后筛选得到的菌株转接产孢培养基大斜面，25℃恒温培养7—10d，无菌水洗下斜面孢子，制成均一孢子悬液，终浓度为106个／mL。取2mL孢子悬液接种固体发酵培养基，25℃培养15d，取出，60℃烘干，测干重(以下称发酵菌质干重)、蛹虫草腺苷以及虫草素含量(以占总发酵菌质干重的百分比计)。
1.6 遗传稳定性试验 将高产虫草菌素的突变菌株连续传代15代，每代培养8d，每代进行固体发酵，检测虫草菌素、腺苷含量及发酵菌质干重的变化，考察突变菌株的遗传稳定性。以未传代CMM－81为对照。
1.7 蛹虫草腺苷和虫草素的HPLC检测 样品处理：准确称取60℃烘干的发酵菌质0.100g，放人带刻度的10mL具磨El塞试管中，加入水，超声波振荡30min，用0.45μm膜过滤后，再取1mL过滤液加入10mL刻度试管或容量瓶中，加入水稀释定容至10mL。
色谱条件：色谱柱，C18反相柱(4.6mmxl50mm，25μm)；柱温，50℃；流动相，10mM KH2PO4溶于甲醇，双蒸水(8:92)；流速，0.8mL／min；进样量，20μL；测定波长254nm。
2 结果与分析
2.1 紫外线照射时间与蛹虫草原生质体致死率的关系 为了确定紫外照射时间与原生质体致死率的关系，将原生质体于紫外线下分别照射0s、10s、30s、50s、70s、90s、110s、130s、150s、170s、190s、210s、250s、300s，涂布再生培养基培养，根据再生菌落数绘制了原生质体紫外线诱变时间效应曲线(图1)。根据试验需要及诱变后的初筛结果将诱变致死率确定在85%左右，即紫外线照射时间为170s。
图1 蛹虫草原生质体紫外线诱变照射时间效应曲线
2.2 紫外线诱变菌株的初筛 以170s为紫外线诱变照射时间，分别照射22批，每批稀释后涂布再生培养基，分离得到快速再生的菌落334个。根据笔者前期研究发现色素与虫草菌素的合成呈正相关。以及梁月等研究报道网产色素菌株比不产色素菌株具有更强的形成子实体的能力。因此，将菌落颜色和生长速率为指标进行诱变菌株的初筛。结果共筛选到7株颜色较出发菌株深，生长较出发菌株快的诱变菌株，即CMM－6、CMM－27、CMM－76、CMM－81、CMM－123、CMM－234、CMM－289。将这些菌株进行下一步的复筛。
2.3 诱变菌株的复筛 将初筛到的7株菌株进行固体发酵，发酵菌质60℃烘干后测定其干重、虫草菌素以及腺苷的含量。结果见表1，初筛获得的7个突变株发酵菌质干重与出发菌株CM9—26无明显差异。有3株突变株即CMM－6、CMM－81、CMM－234发酵产物的腺苷含量高于出发菌株，其中CMM－81的腺苷含量最高，达到0.036%，是出发菌株的2倍。7个突变株发酵产物的虫草菌素含量均高于出发菌株，其中CMM－81虫草菌素含量最高，达到0.437%，是出发菌株的2倍。综合发酵菌质干重、虫草菌素及腺苷含量，复筛得到1株较优良的突变株CMM－81。
2.4 突变株CMM－81遗传稳定性 将复筛得到的突变菌株CMM－81连续传代15代，以发酵菌质干重、虫草菌素和腺苷为指标来评价其遗传稳定性。一般认为连续传代10－15代后各项指标相对于未传代菌株的变化率在≤±5%为遗传稳定的菌株。表2显示，CMM－81传代15代后其发酵菌质干重变化很小，最大变化率为0.77%；发酵物中虫草菌素及腺苷含量的变化也不大，变化率分别为O.92%及2.78%。由此表明，CMM－81能稳定合成虫草菌素，具有很好的遗传稳定性。
表1 发酵菌质干重、虫草素及腺苷含量
表2 菌株CMM－81遗传稳定性试验结果
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