培养基灭菌有物理法和化学法，其中较多使用、而且效果好、效果稳定的是物理法的热力灭菌法。常用的方法有高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、间歇性灭菌法、过滤除菌、化学药剂灭菌法。
1.高压蒸汽灭菌：要求有高压蒸汽锅，技术指标最高温达140℃或2kg/㎡压力。物品在密闭容器内，水经过加热产生高压蒸汽而提高温度达到灭菌的目的。一般培养基可用121℃保持20min即可达到灭菌效果，已经把菌丝营养体、孢子、芽孢全部杀死。但如果基质内含有葡萄糖、马铃薯、豆芽汁、维生素等物质则应用115℃保持20min为宜，否则过高温度会破坏营养物，而产生有毒物质不利于食用菌生长。木屑、甘蔗渣、棉籽壳、麦粒、草料、粪干等物质原来含菌量较大而且含水量较少，宜用129℃保持1-2.5h灭菌。
2.常压蒸汽灭菌：物品在锅内以常压蒸汽经行灭菌。通常蒸汽温度为95-105℃，因此，灭菌的时间要求6-8h才能达到效果。这种方法适合人力，燃料充足，未有能力购置高压蒸汽锅的地方使用。这种方法对保持培养基的养分较好。
3.间歇性灭菌法: 对不宜超过100℃高温的物品较好。培养基置锅内经100℃高温蒸，杀死杂菌的营养体，保温在25-30℃24h，残留的孢子萌发成营养体。进行第二次蒸煮1h把萌发的孢子杀死。同法，进行第三次蒸煮1h保温等做法，即可达到完全灭菌的效果。
4.过滤除菌: 一些不耐高温的物品经过机械阻留的技术把杂菌出去。如血清、维生素、氨基酸等物多用此法除菌。要求设置抽滤瓶和空气压缩机才能进行。
5.化学药剂灭菌法: 常用的化学药剂有氯化汞、高锰酸钾、漂白粉、福尔马林、酒精等。在食用菌栽培中，这些化学剂的灭菌效果不稳定，而且有些影响到产品的安全性，如氯化汞不宜用于食物，而多用于表面消毒或环境消毒。
