（1）选革选择生长正常、健壮、无病虫害的新鲜蛹虫草做分离材料。用野生早期生长（8月底以前出土的）蛹虫草分离得到的蛹虫草菌种具有明显早熟性（即早出草）。菌种分离可采用泡子分离或组织分离等方法，生产上常用组织分离获得纯菌种或进行菌种复壮。
（2）消毒将鲜蛹虫草用清水洗去外表泥土，再用0．1%升汞水溶液消毒l～3分钟，用无菌水冲洗数次，然后再用75%酒精浸泡3～5分钟，用无菌水洗净后进行分离。
（3）分离先用解剖刀切去虫体外部，避开肠道，然后切取内部白色组织块或子座内的组织块，接种到斜面母种培养基上。以蛹虫草子实体有龟背状花纹的顶端组织获得菌种种性最好。
（4）选择抑菌培养基分离培养基最好采用加有50毫克/升链霉素的加富培养基。如采用其他培养基进行分离，在培养基中加入一定量的抑菌剂会提高分离效果。常用抑菌剂使用量和加入方法如下：链霉素 30～50毫克/升，灭菌后冷却至 45℃时加入；金霉素 20～30毫克/升，灭菌后冷却至 45℃时加入；青霉素 20毫克/升，灭菌后冷却至 45℃时加入；牛胆汁 5克/升，配制时加入；孟加拉红 35毫克/升，培养基煮沸时加入。
（5）培养分离接种后，在 20℃恒温箱内培养 10天左右，挑选性状良好的母种作为菌种。
（6）鉴定优良菌种标准是：菌丝白色，粗壮浓密，呈匍匐状紧贴培养基生长，边缘整齐，无明显绒毛状白色气生菌丝，后期分泌黄色色素，菌丝见光后变为橘黄色。将分离菌种进行扩大培养后，接种在米饭培养基上进行出草和鉴定。于18℃～20℃温度下培养20～30天，如果无污染则继续培养，l个月后即可形成橙红色子实体。经鉴定种性，选择性状优良菌种用于生产。
培养基
以大米、玉米等作主料，另添加10%-25%的蚕蛹粉或奶粉妈提高蛹虫草子实体的品质。将培养料与营养液以1：1比例拌匀，pH值掌握在5.5-7.0。按常规装瓶、灭菌、接种。
菌丝体培养
接种后的料瓶，应置于清洁、避光的环境中培养，保护空气湿度60%。初始阶段，为减少杂菌污染，室内温室宜保持在15℃-18℃之间，待料面布满虫草菌丝后，将温度提到20℃-23℃，持续15d左右，菌丝即可吃透培养料，完成营养生长。
