母种是采用孢子或组织分离培养获得和保存的灵芝纯菌丝体，并经栽培试验鉴定，具有优良经济性状且相对稳定的试管种。
一般芝农可以从科研单位或者菌种保藏机构引进灵芝母种，技术力量较强的生产单位，也可通过组织分离制备灵芝母种。
（一）培养基配制
（1）培养基配方
1、PDA培养基
马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。
2、综合马铃薯培养基
马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。
3、马铃薯麦麸综合培养基
马铃薯（去皮）200克，麦麸100克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。
4、马铃薯酵母粉综合培养基
马铃薯200克，葡萄糖20克，酵母粉4克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。
（2）培养基的制作步骤
材料选择—>准确称量—>萃取—>配制定量—>分装—>调PH—>灭菌（121°C、30分钟）—>斜面摆放（培养基长度为试管长度的2/3）。
（3）PDA培养基制备方法
称取去皮、切片的马铃薯200克，置于锅内，加入水1000毫升，煮至薯片软而不烂。用4-6层纱布过滤，取滤液。向滤液中加入琼脂20克，继续煮沸至琼脂完全融化，加入葡萄糖20克，补水至1000毫升。趁热分装于试管中，装至试管长度的1/5-1/4，擦净管口，塞上棉塞或者硅橡胶塞。棉塞力求大小规范，松紧适中，不能出现缝隙。然后，在0.11兆帕、121°C条件下灭菌30分钟。
灭菌后、斜放试管，摆放斜面，使培养基前端蔓延至试管长度1/2，盖上纱布或灭菌的报纸（防冷凝水过多），待培养基凝固（静置24小时）后，取3-5支试管置于30°C培养3天，若无杂菌出现，表明灭菌彻底，可供接种用。
（二）菌种分离与培养
（1）种芝选择
生产中，一般选用无病虫害的6-7分成熟的鲜芝做种芝。种芝表面可经紫外照射消毒、酒精擦拭消毒。
（2）组织分离
组织分离之前，先用酒精棉球擦拭种芝的表面，再将菌盖撕开，一分为二。一般选择灵芝菌盖黄白色生长区菌肉组织或者灵芝菌柄上方菌盖中部的菌肉组织为取种部位。组织分离时，可先用无菌手术刀小心切割灵芝菌肉，然后用接种针取5毫米x5毫米的小块菌肉组织，接入试管培养基中上部表面。
（3）培养
将上述分离物置于生化培养箱中培养。
调温至28-30°C，避光培养。经过2-3天，菌肉组织既可开始萌发，出现肉眼可见的菌丝体，并在培养基表面逐渐蔓延。一般7-10天可长满试管斜面。如果分离物（菌肉组织）不到2天就出现肉眼可见的菌丝体，多事杂菌。如果分离物（菌肉组织）培养4天仍为出现肉眼可见的菌丝体，可能是切割灵芝菌肉组织的手术刀或接种针在酒精火焰上方灼烧之后没有充分冷却，或者其它原因导致分离物（菌肉组织）失去活性而不能萌发菌丝体。
灵芝菌丝体洁白、纤细、平坦、致密、均匀，随着菌丝的生长、菌落的扩展，接种块处的菌丝逐渐老化形成坚韧的菌皮，并随着菌皮的老化，色泽逐渐变为淡黄色。
（4）质量要求
挑选灵芝菌丝体生长整齐，长速正常，菌丝外观饱满，长势旺盛，气生菌丝洁白、纤细、平坦、致密、均匀的分离物作为备用菌种。
（三）母种生产过程中的注意事项
（1）指定适宜的菌种生产计划，母种在试管长满后可在冰箱中保藏一段时间，但原种和栽培种长满瓶（袋）后要求尽快用于生产。
（2）无论是组织分离获得的菌种还是购买的菌种，都要进行栽培试验，符合生产要求的菌种可用于规模化生产。菌种选择有误，将会对生产造成不可估量的损失。
（3）进行菌种的组织分离和转管，必须严格遵循无菌操作的有关要求。
（4）尽量避免多次转管。在转管过程中可能出现基因突变，使菌种退化，降低菌种的生活里。通常，灵芝母种经过3-4次转管后，就需要重新进行分离复壮，重新进行栽培试验，汰劣存优。
