一是褶片贴附分离法。利用成熟菇体的菌盖所产生的孢子进行培养而获得纯正菌种。其过程是：首先制备好PDA试管斜面培养基。配备培养基的用品是马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升。将试管存放在14℃～18℃环境中干燥2天～3天，当试管壁上没有游离水珠时，即可进行分离，方法是：选用菇形圆整、菌盖肥厚、健壮、无病虫危害、七八成熟的平菇作为分离菌种原材料，在黑暗处借用手电筒的光束，可看到形似白色粉笔灰状的孢子弹射的状况。平菇孢子的成熟次序是由基部，即靠近菇体菌柄的一端呈带状向前缘推移，在其菌盖前缘隆起处便是孢子弹射最活跃的部位，在此处剪一段，约1厘米～1.5厘米宽的菌褶，用镊子剥取2片菌褶，并用75%酒精涂抹消毒，再将其贴到斜面试管上方的管壁上，并立即竖放到广口瓶或纸盒内。在瓶或盒底部放一层棉花（最好用脱脂消毒棉），固定住试管，以防止试管滑动。然后轻轻调整试管方向，使表面呈凸凹放射状排列的菌褶面向试管内的斜面培养基，以便弹射孢子能自由降落到培养基上。在18℃温度下，一般放置12小时，斜面培养基上即可看到与呈放射状排列的菌褶形状相似的模糊的孢子印。此时，在无菌接种室或接种箱内，用接种钩将贴附的菌褶取出并塞上无菌脱脂棉塞。封闭管口，以免落下成熟过迟的孢子，然后竖立在26℃温度下进行培养。3天后，孢子呈棉花团状萌发，10天左右，菌丝即可长满试管斜面。然后再在无菌接种室或箱内，用接种针将载有菌丝的小块移入另一斜面试管培养基内培养，这样重复2次，进行无杂菌培养。经感官鉴定：分离培养的菌种菌丝密集、粗壮有力，气生菌丝发达，爬壁性强，不分泌色素，菌丝生长速度快，耐高温，在34℃温度下照常生长而不发黄，25℃温度下约8天可长满试管斜面，在低温下保存易形成籽实体。通过出菇试验，证明这种方法产量高、周期短、抗杂菌污染能力强，可选择出优良菌株并作为原始纯菌种转扩再用于生产。
二是孢子快速分离法。在乎菇孢子大量散发出现烟雾状时，可采用医用注射器进行孢子快速分离而获得纯菌种。平菇孢子分离的菌种生理年龄小，生活力旺盛，常被当作菌种复壮的方法之一。具体方法如下：①用100毫升的医用注射针管和长针头，经75%酒精消毒后，吸入40毫升的无菌水。②推出注射器中的空气，将针管头插入菇体孢子弹射的烟雾圈中，拔出针头，将针管后拉，使烟雾中的部分孢子随针头管后拉的吸力进入管内，然后立即插上针头并晃动针管，使吸入的孢子与无菌水混合均匀，即成孢子液。③用酒精棉球擦试针头后，将针头插穿PDA培养基斜面试管上的棉塞，稍压推管，滴入3滴孢子液在斜面培养基上，轻轻晃动试管使其均匀铺开在斜面上。④将斜面试管水平置于24℃～26℃下培养，待孢子萌发时，挑选无杂菌污染、洁白、健壮的菌丝，在无菌接种室或接种箱内转管2次，进行纯化培养。经过出菇试验后，选择优良菌株作为纯种。
注意事项：操作者要戴口罩、手套，并穿着白色医用隔离衣。操作前出菇房最好先通风，并根据实际情况进行喷雾，使已弹射的孢子沉降地面，以免危害人的身体健康。
